黄芪苷类对乙醇诱导GES-1细胞株损伤的保护及机制研究

一、研究背景 乙醇(酒精)引起的胃粘膜损伤性疾病是临床上的常见多发性、难治疾病,包括胃溃疡、胃炎、胃粘膜应激性损伤等。乙醇在日常生活中的滥用,则是该疾病高发率的重要诱因之一。有研究报道,乙醇在对机体造成损伤时,可通过诱导机体合成和分泌活性氧簇(ROS),ROS通过细胞氧化应激反应,攻击细胞的基本成分,一方面诱导磷脂膜中脂肪酸的过氧化反应,从而导致了类似脂质过氧化物、氧自由基及脂质分解物等有毒物质的产生；另一方面诱导细胞凋亡甚至导致其坏死。高浓度的ROS具有细胞毒作用,可引起细胞凋亡、坏死。 在前期研究中,发现黄芪总苷作为黄芪的主要有效部位,在调节细胞信号传导功能的同时,具有保护胃粘膜屏障、维持组织结构完整性,调节整体胃酸分泌的重要作用；在对黄芪总苷和黄芪甲苷的药代动力学的研究中发现,无论预防给药还是治疗给药,黄芪总苷和甲苷均可促进胃粘膜细胞增殖、抑制细胞凋亡,改善乙醇导致的大鼠胃粘膜上皮细胞细微结构的病变,从而发挥保护胃粘膜急性损伤的作用。 基于已有的研究基础,本研究采用人胃粘膜上皮细胞株(GES-1)作为研究对象,在细胞增殖、分子蛋白及基因表达的变化等方面,探讨黄芪苷类对乙醇诱导人胃上皮细胞株(GES-1)凋亡的保护作用机制。 二、研究方法与结果1、建立乙醇诱导人胃上皮细胞株(GES-1)损伤模型 方法：以乙醇作为刺激剂,应用罗氏细胞实时动态分析仪(RTCA)、MTT匕色法、Hoechst染色法、Annexin V-FITC/PI凋亡流式检测研究不同浓度的乙醇,在不同刺激时间的作用下对GES-1细胞株细胞形态及功能的影响。 结果：(1)当乙醇浓度大于0.5M时,对GES-1细胞株有明显的损伤凋亡作用,且凋亡作用优于TNF-α (100ng/ml、50ng/ml);(2)通过形态学观察,发现乙醇模型组GES-1细胞株出现明显的凋亡细胞形态学改变；(3)Annexin V-FITC/PI凋亡流式分析发现乙醇浓度大于0.2M对细胞具有明显的诱导凋亡作用,主要诱导GES-1细胞株进入早期凋亡,且具有浓度依赖性；但该诱导作用具有短时效性,在作用持续1h后,其凋亡作用会逐渐减弱。 2、黄芪总苷(AST)、黄芪甲苷(AS)对人胃上皮细胞株GES-1增殖的影响 方法：采用MTT法和细胞实时动态分析仪检测法(RTCA),观察了3个时间点(12h、24h、48h),不同浓度的AST、AS对胃粘膜上皮细胞增殖的影响。 结果：(1)预先给予AST浓度达到2Oug/ml、AS浓度达到5ug/ml,药物预先作用12h、24h、48h对GES-1细胞株均出现了明显的促增殖作用；(2)在所考察的浓度范围内,即当AST、AS的给药剂量达到100ug/ml时,对人胃上皮细胞株未显现明显的细胞毒性；(3)采用MTT法和细胞实时动态分析仪两种检测分析方法所检测结果基本一致。 3、黄芪总苷(AST)、黄芪甲苷(AS)对GES-1细胞乙醇模型增殖的影响 方法：以黄芪总苷低、中、高剂量组(20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml)及黄芪甲苷的低、中、高剂量组(5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml)处理细胞24小时后,再给予0.8M的乙醇刺激4h,MTT比色法检测胃粘膜上皮细胞的活力和Annexin V-FITC/PI凋亡流式检测分析对细胞凋亡的影响。 结果：(1)黄芪总苷的中、高剂量组及黄芪甲苷的低、中、高剂量组均能明显提高细胞在乙醇中的存活力,对6ES-1细胞乙醇模型的增殖有一定的促进作用(p<0.05)；(2)黄芪总苷的中、高剂量组和黄芪甲苷的高剂量组细胞在乙醇中存活状态甚至接近正常对照组；(3)与模型组相比,黄芪总苷、甲苷的各个剂量组具有明显抑制乙醇诱导GES-1细胞凋亡的作用(p<0.01)；(4)黄芪总苷的低剂量组(20ug/ml)对乙醇致GES-1细胞株损伤细胞的增殖促进作用不明显(p>0.05)。 4、黄芪总苷(AST)、黄芪甲苷(AS)对GES-1细胞乙醇模型的Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达的影响 方法：以0.8M乙醇刺激细胞4h建立胃上皮细胞的损伤模型,应用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测分析黄芪总苷、甲苷对胃上皮细胞损伤模型Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表达水平的影响。 结果：黄芪总苷和黄芪甲苷的高、中、低剂量组均可明显下调GES-1细胞乙醇模型中促凋亡蛋白Bax、Caspase3的表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平；提示黄芪苷类成分可能从调控细胞凋亡途径方面保护乙醇对胃粘膜上皮细胞的损伤。 5、黄芪总苷(AST)、黄芪甲苷(AS)对GES-1细胞乙醇模型的ERK/JNK/P38蛋白表达的影响 方法：采用0.8M乙醇刺激细胞4h建立胃上皮细胞的损伤模型,蛋白质免疫印迹法Western Blot检测分析黄芪总苷、甲苷对GES-1细胞乙醇模型磷酸化ERK/JNK/P38蛋白表达水平的影响。 结果：(1)与正常对照组(Normal)相比,模型组(EtOH)的磷酸化ERK、JNK、P38的表达显著升高(p<0.01)；(2)不同浓度组的黄芪总苷、黄芪甲苷预保护组与模型组(EtOH)相比,均能明显降低磷酸化ERK、JNK、P38的表达(p<0.01)；提示ERK/JNK/P38MAPK信号途径可能是黄芪总苷、甲苷保护胃粘膜的重要转导途径之一。 6、黄芪总苷、黄芪甲苷对GES-1细胞乙醇模型的Caspase3、Bax、JNK、ERK、P38基因表达的影响 方法：应用荧光定量PCR方法检测黄芪总苷、甲苷对GES-1细胞乙醇模型的Caspase3、Bax、JNK、ERK、P38mRNA表达水平的影响。 结果：(1)Caspase3、Bax、JNK、ERK、P38mRNA在模型组(EtOH)中的表达水平显著性的高于正常对照组和黄芪总苷、黄芪甲苷高中低剂量组(p<0.01)(2)与模型组相比,Caspase3、Bax、JNK、ERK、P38mRNA基因水平在黄芪总苷、黄芪甲苷给药组均有显著性降低(p<O.01)；提示提示黄芪总苷和黄芪甲苷可能通过抑制乙醇对GES-1细胞株损伤状态下Caspase3、Bax、JNK、ERK、P38mRNA的表达,以保护胃粘膜上皮细胞。 三、研究结论 1、黄芪总苷、甲苷对正常及乙醇诱导损伤的GES-1细胞株均有具有提高细胞生存活力、减少凋亡细胞,促进增殖的作用。 2、乙醇诱导的GES-1细胞株损伤与Bcl及ERK/JNK/P38MAPK信号途径相关；黄芪总苷、甲苷可通过影响Bcl及ERK/JNK/P38MAPK信号途径的相关蛋白,促进乙醇诱导胃粘膜细胞株损伤的修复。