目的：①通过本研究评价传统中药单体红景天苷在诱导小鼠骨髓间充质干细胞(D1细胞系,CRL-10915)向神经元样细胞分化过程中的作用,初步阐述其作用方式和分子机制。
②探讨细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK1/2)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylionsitol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of Rapamycin, PI3K/AKT/mTOR)信号通路在介导红景天苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化中的作用。
方法：①以小鼠BMSCs细胞系(D1细胞)作为研究对象,建立体外诱导模型,实验分为对照组和红景天苷诱导组。诱导组以100μg·mL-1的红景天苷分别作用细胞12h、24h、48h和72h。采用细胞免疫荧光染色方法检测细胞神经细胞神经特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase NSE)、神经元微管蛋白Ⅲ(p-Tubulin-Ⅲ,β-tub)、微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein-2, MAP2)、神经干细胞巢蛋白(nestin, NES)和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的阳性率；蛋白免疫印迹法(Western blotting)和实时定量PCR(Real-time PCR)方法分别检测NSE、β-Tubulin-Ⅲ、GFAP的蛋白和mRNA表达情况。
②建立体外诱导模型,红景天苷分别以不同浓度(5μg·mL-1、25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1和200μg·mL-1)作用于细胞24h以及相同浓度(100μg·mL-1)分别作用细胞3h、6h、12h和24h。采用Western blotting方法检测NSE、β-Tubulin-Ⅲ、ERK1/2、P-ERK1/2、AKT、P-AKT的蛋白表达情况；实时定量PCR (Real-time PCR)方法检测MAPK3、AKT、Ps6k的mRNA表达情况。利用特异性信号通路阻断剂PD98059、LY294002以及Rapamycin分别阻断ERK1/2以及PI3K/AKT/mTOR信号通路,Western blotting和Real-time PCR方法分别检测阻断后相关ERK1/2.NSE以及AKT的蛋白表达情况以及MAPK3、 AKT、Ps6k、NSE、Nr4a2和NES的mRNA表达情况。
结果：①显微镜下显示细胞随着培养时间的增加,形态从圆形向梭形转变；MTT细胞活性检测结果显示细胞在诱导48h时活性最高(P<0.05)；免疫荧光染色结果显示,红景天苷诱导BMSCs不同时间点后β-Tubulin-Ⅲ、NSE、MAP2、 NES和GFAP均有表达,其中12h时GFAP细胞阳性表达最高,24h时β-Tubulin-Ⅲ阳性表达最高,48h时NSE和MAP2阳性表达最高；72h时NES阳性表达率最高,与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01)；蛋白免疫印迹结果显示随着红景天苷诱导时间的延长,β-Tubulin-Ⅲ和NSE蛋白表达丰度呈现先上升后下降的趋势,在48h时蛋白表达丰度最高,差异有统计学意义(P<0.05),两者在一定程度上呈现时间依赖性；实时定量PCR结果显示,两者在不同诱导点mRNA均有表达,24h时基因表达最高。
②在研究ERK1/2和PI3K/AKT/mTOR信号通路中,MTT检测结果显示,随着红景天苷诱导浓度增加,细胞活性呈现先增高后降低的趋势；蛋白免疫印迹结果显示：不同浓度组,BMSCs表达相关神经蛋白NSE和β-Tubulin-Ⅲ均呈现表达上调趋势,相关信号通路蛋白ERK1/2, P-ERK1/2和AKT的蛋白表达随着诱导浓度的增加而逐渐上调,差异有统计学意义(P<0.05)；不同时间组ERK1/2和P-ERK1/2随着诱导时间延长而上调(P<0.05), AKT则呈现先升高后降低的趋势；阻断相应信号通路后,ERK1/2、NSE、AKT的蛋白表达量均显著下调(P<0.01)；实时定量PCR结果显示：诱导1组MAPK3和AKT在25μg·m-1、25μg·m-1和20μg·m-1时基因表达高于对照组(P<0.05),随着诱导浓度的提高,其mRNA的表达在一定范围呈现上调趋势；诱导2组中,MAPK3在3h和24h时高于对照组,AKT则在6h和24h处高于对照组(P<0.05),Ps6k的mRNA表达随着时间的延长而上调(P<0.05)；阻断ERK1/2和PI3K/AKT/mTOR信号通路时,MAPK3, AKT和Ps6k则表达均下调(P<0.05),其下游相关基因NSE、 Nr4a2和NES的mRNA表达随着信号通路阻断呈现显著下调(P<0.01)。
结论：①红景天苷在一定条件下能够有效的诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的定向分化。
②红景天苷诱导小鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化在分子机制上与ERK1/2和PI3K/AKT/mTOR信号通路存在密切关联,它通过激活相关信号通路来促进BMSCs的分化。
