石榴皮抗氧化物质提取及其抗氧化、抗动脉粥样硬化作用研究

目的：本研究摸索提取石榴皮抗氧化物质最佳条件，考察提取物体外对多种自由 基的清除能力及对LDL氧化的影响、对高脂饲料喂养动物AS形成的防治作用以 及体外对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用，并与石榴果肉提取物相比较，为研 究石榴皮中的抗氧化活性成分及其相互作用、充分开发石榴及相关产品的保健功 能等奠定基础。 军事医学科学院博士学位论文 摘要 1.动物及分组:采用对AS敏感的日本大耳白兔建立AS动物模型，分组情况 同C57BL/6)小鼠实验，每只每天分别喂以高脂饲料或含提取物的高脂饲料259， 加上基础饲料759，对照组喂基础饲料1009，自由饮水，实验周期3个月。 2.检测指标:采用心脏采血，观察血脂动态变化，并于实验结束时检测血FRAP 值、GSH一Px活性、SOD活性及MDA含量;部分主动脉用于石蜡包埋切片及HE 染色;自降主动脉起始处至腹主动脉分叉处取动脉大体标本，苏丹IV脂肪染色， 检测斑块面积。 第四部分:石榴皮提取物体外对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用 (一)E Cv304细胞体外培养及ox一LDL损伤模型的建立 ECv304细胞Ox一LDL损伤模型的建立:以cu2+诱导氧化LDL制备ox一LDL， 按照Ox-LDL中MDA浓度进行分组，造成VEC氧化损伤，通过检测细胞培养液 中LDH活性、细胞MTT值、观察细胞形态变化，选择适宜的Ox一LDL浓度建立 氧化损伤模型。 (二)石榴皮提取物对氧化损伤Ecv304细胞的保护作用 1.实验设计:实验分为Control组、Ox一LDL组、Ox-LDL+VE组(VE+)、 Ox一LDL+EPE组(EPE一L+、EPE一M十、EPE一H十，EPE浓度分低、中、高三个剂量)、 Ox一LDL+EPU组(EPu一L+、EPu一M十、EPu一H+，EPu浓度亦分三个剂量)，取单层 生长的细胞，分别加入VE、EPE、EPU预孵24h，换液，再加Ox一LDL培养24h。 2.检测指标:检测细胞MTT值、SOD、FRAP值，检测培养液及细胞NO含 量、LDH活性、细胞膜流动性、单核细胞一内皮细胞粘附率、细胞凋亡，电镜观察 内皮细胞形态学改变。 结果: 1.石榴皮抗氧化物质提取的最佳溶剂为混合溶剂，最佳提取条件为:用pH为 6的混合溶剂于80℃提取1.5h，液料比为10:1。以此方法提取可获得较高的收率， 石榴皮提取物中多酚类化合物和类黄酮物质的含量明显高于石榴果肉提取物，急 性毒性试验提示提取物实际无毒。 2.石榴皮提取物在体外能有效清除02一、·oH、ROO·自由基，抑制共扼二烯 的生成，保护LDL免于氧化，并具有剂量效应关系，同等重量的石榴皮提取物比 果肉提取物具有更强的活性。 3.石榴皮提取物能够提高C57BL/6)小鼠血抗氧化防御体系功能(包括FRAP 值、抗氧化相关酶GSH一Px和Paraoxonase的活性)、调节血脂水平(包括降低血 总胆固醇、LDL一ch、TG水平，提高血HDL一ch含量，降低肝脏脂肪和胆固醇含量、 心脏+主动脉胆固醇含量)、抑制平滑肌细胞的迁移和脂质蓄积，发挥抗AS的活 性。石榴果肉提取物也有类似作用。 军事医学科学院博士学位论文摘要 4.石榴皮提取物可提高大白兔血抗氧化防御体系功能(包括FRAP值、GSH一Px 和SOD活性)，降低动脉粥样斑块的面积，减轻AS的程度，对血脂的调节作用则 不明显。石榴果肉提取物也有类似作用。 5一定浓度的Ox一LDL可以造成ECV304细胞氧化损伤，石榴皮提取物能够 提高氧化损伤VEC的细胞活力，改善细胞抗氧化防御体系功能(S OD活性、FRAP 值)，减轻细胞氧化损伤(LDH活性、细胞膜流动性)，抑制细胞凋亡，促进NO 分泌，降低单核细胞一内皮细胞粘附率，电镜检测显示提取物可维持VEC的正常形 态，减轻Ox一LDL对VEC的氧化损伤。同等重量的石榴皮提取物比果肉提取物有 更强的活性。 结论:石榴皮提取物通过清除多种自由基(寸一、·oH、Roo·)、提高抗氧化相关 酶(GSH一Px、SOD、PON)活性来提高血抗氧化防御体系功能、减少Ox一LDL的产 生的氧化应激损伤，同时通过促进NO合成来降低血小板及单核细胞的粘附、平 滑肌细胞的迁移和增殖;此外，对血脂也有潜在的调节作用。尽管果皮提取物较 果肉提取物中含有更多的抗氧化物质(多酚类物质、类黄酮物质)，并在体外表现 出更强的相关活性，但在整体动物实验中没有表现更显著的抗AS形成的作用。因 此，有关石榴皮提取物中的有效成分尚有待于进一步深入研究。