近年来,人们对多糖类物质的研究逐渐成为新热点,同时对其分离纯化技术、结构分析及活性物质的研究也日益深入。研究发现,羊肚菌多糖具有抗菌、抗肿瘤、抗疲劳、增强免疫力等多种活性,但对于其具体作用机制现在仍有待进一步深入研究。本课题侧重于羊肚菌多糖结构和抗肿瘤机理的研究,弄清多糖的这些分子特征,能深入了解它们的结构与活性之间的构效关系及生物活性作用机理,为多糖在药物领域的开发与应用提供理论基础和实验依据。
实验中首先用响应面法对培养过程中影响多糖产率的各种条件进行优化避免对材料和资源的浪费；继而对提取纯化出的羊肚菌多糖的结构特点进行阐述；最后对多糖作用于HepG2细胞后通过诱导细胞凋亡对肿瘤细胞进行抑制这一机制途径进行研究。
(1)响应面法优化发酵条件：以羊肚菌GIM5.69为研究对象,首先对影响羊肚菌发酵产生胞外多糖MEP的诸多外界因素进行Plackett—Burman设计实验,筛选出主要影响因素；然后采取响应面法,用Box—Behnken设计实验探寻各影响因素的最佳水平。结果：羊肚菌胞外多糖的最佳液体发酵培养条件为,蔗糖3.98%,养时间5.98d,转速217.44r/min。此条件下的验证试验表明,此时胞外多糖的得率为53.04%,与理论值基本吻合,误差仅为1.64%。
(2)多糖提取采取水提醇沉的方法获得后,通过Sevage法除去蛋白；然后经DEAE-Sepharose F·F离子交换柱分离,并用NaCl溶液进行梯度洗脱,分别收集后苯酚-硫酸法检测多糖含量,得到两种羊肚菌多糖成分MEP-I和MEP-Π,再经过AKTASuperdex-200柱层析进一步分离纯化。MEP-Ⅰ和MEP-Ⅱ两种成分的分子量大小是通过HPLC/ELSD色谱分析得到,通过红外FT-IR和色谱HPLC/ELSD分别测出这两种成分的结构特点和分子量大小。结果如下：MEP-I,MEP-Π分子量为3.91×103和1.58×105Da,两种成分均由甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(G1u)组成,但两者的摩尔比不同,其中葡萄糖的含量最大,摩尔比分别达到84.64%和78.39%,其次还含有阿拉伯糖(Ara)和鼠李糖(Rha)。并通过并间羟联苯法测定其成分中含有少量糖醛酸。红外光谱结果表明两种成分还具有羧基的特征吸收峰,这与理化性质所测的结果是一致的。扫描电镜观察到羊肚菌多糖的外部形貌,多糖是由很多呈球状或圈状形貌的固体颗粒,这些球状和圈状的结构可进一步连接或侧向聚集成链状或网状结构。
(3)MTT法确定羊肚菌多糖MEP对HeLa、HepG2及AS49三种肿瘤细胞的抑制率大小,选取一种效果最为明显的肿瘤细胞HepG2细胞进行以下的研究。首先形态学方面观察细胞的凋亡情况,通过荧光显微镜和透射电镜观察羊肚菌多糖MEP诱导细胞凋亡时细胞的变化情况,发现诱导后的细胞具有明显的凋亡特征。同时为了研究细胞凋亡过程中一些因子的变化情况解释细胞发生凋亡的途径,实验采用不同浓度羊肚菌多糖作用HepG2细胞后,通过AnnexinV-FITC/PI双染后流式细胞仪检测表明,羊肚菌多糖可以诱导HepG2细胞凋亡。观察MEP对HepG2细胞内ROS(需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇)的影响发现,MEP能够诱导ROS的浓度逐渐增高；同时用荧光染料Dioc6(3)染色法观察MEP对HepG2细胞线粒体膜电位的影响,随着药剂作用剂量的升高,膜电位下降越明显,膜电位的变化导致细胞破裂并释放凋亡因子,这些都使细胞发生程序性死亡即凋亡。
