叶片衰老抑制基因PSAG12-ITP转化小麦的研究

利用优良品种以提高作物产量是农业生产上经济易行的措施。目前，我国生产上种植的一些小麦品种（系），叶片过早衰老现象是一个不容忽视的问题，严重制约着品种产量潜力的发挥和影响品种的推广应用。采用常规育种方法根据表现型进行性状改良，易受环境条件影响，收效较差。近年来，应用植物转基因技术改良作物品种已显示出巨大的潜力。Gan和Amasino构建的叶片衰老抑制基因PSAG12—IPT导入烟草和水稻后，转基因植株的形态、生育期与对照基本一致，而结实率，单株产量有所增加，叶片衰老得到明显延缓。本试验利用农杆菌浸泡种子法和花粉管通道法2种植物遗传转化技术将叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT导入了生产上有早衰缺陷的小麦品种西农1376，并从目标性状和分子水平上研究了外源基因的转移、整合、表达与遗传；对农杆菌常规介导法转化小麦及卡那霉素在转基因小麦后代筛选中的应用也进行了探讨。获得的主要研究结果如下： 1．利用农杆菌浸泡种子法，以西农1376和西农2611为受体，获得了1株导入了叶片衰老抑制基因PSAG12—IPT的转基因小麦。经PCR，GUS组织化学染色和Southern杂交分析，证明目的基因已整合到小麦基因组中。T1代的PCR分析结果表明，转基因植株能稳定遗传，后代株系的分离规律符合孟德尔的3:1分离模式。转基因小麦在叶片细胞分裂素含量，叶绿素含量，叶片衰老进程及农艺性状等方面与对照西农1376无明显差异，表明叶片衰老抑制基因PSAG12—IPT在转基因植株体内可能未表达（发生基因沉默）或表达量不足。 2．以西农1376和京花1号小麦幼胚的胚性愈伤组织为受体，利用农杆菌常规介导法进行转化，获得了少量抗性愈伤组织。经GUS组织化学染色，证实叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT已经导入了西农1376小麦的愈伤组织中，并实现转化，但未能获得再生植株。通过比较不同浓度潮霉素的筛选效果及不同培养基的分化结果，初步证明在利用农杆菌常规介导法转化小麦时潮霉素的适宜筛选浓度为110mg／L，分化培养基以添加IAA1.0mg／L+KT1.0mg／L的MST培养基较为理想。其中，西农1376较京花1号小麦更适于利用农杆菌常规介导法进行转化。 3．利用花粉管通道法，以西农1376为受体，采用100ng／ul，400ng／ul、700ng／ul三种浓度质粒DNA进行转化，获得了5株导入了叶片衰老抑制基因PSAG12-IPT的转基因小麦。经PCR、GUS组织化学染色、点杂交和Southern杂交分析，证明带有特异启动子的目的基因已整合到小麦基因组中，并以700ng／ul浓度质粒DNA的转化效率较高。通过叶片细胞分裂素含量、叶绿素含量、叶片衰老进程及农艺性状分析，证明PSAG12—IPT基因在2株转基因小麦的衰老叶片中特异表达，叶片衰老受到明显 l 的抑制；而在另外3株转基因小麦中PSAGIr二PT基因可能非特异性表达、不表达或 表达量不足。TI代的PCR分析结果表明，大部分转基因植株能稳定遗传，后代株系 的分离规律符合孟德尔的3：l遗传模式，而少数株系呈其它比例分离。在小麦生育 后期，观察到部分L代植株叶片衰老明显延缓，早衰现象得到改善。根据本试验的 研究结果，表明可以利用PSAG12－WT基因对生产上有早衰缺陷的小麦品种进行遗传改 良，以最大程度地发挥现存品种的生产潜力及为育种创造新种质。这也可能是挖掘小 麦产量潜力的一条新的途径。 4．用 0、40mg／L、80m叭、120mg／L、160mg／L、200mg／L 6it水平卡那霉素 分别处理西农 1376和西农 2611种子，结果表明：80mg／L卡那霉素能有效抑制非转 化小麦幼苗的正常生长；小麦不同基因型对卡那霉素的敏感性稍有差异。经PCR检 测，80th叭卡那霉素筛选出乃代西农1376（转PSAGI厂二PT基因）抗性苗的阳性率 达到90％，证实用80mg／L卡那霉素对转基因小麦后代进行筛选具有可行性和有效性。 这一结果对花粉管通道法转基因小麦的当代筛选也有借鉴价值。