乳酸乳球菌发酵生产大豆异黄酮的研究

大豆异黄酮是大豆中的一种生物活性物质,近年来,研究表明,大豆异黄酮是具有保健功能的物质,其具有抗肿瘤活性、抗心脑血管疾病、抗骨质疏松及防止机体免疫力下降等生理活性。随着人民生活水平的提高,大豆异黄酮作为医药或保健食品的原料或添加剂,市场需求逐年增长,人们对大豆异黄酮的需求量越来越大,越来越受到人们的关注,大豆异黄酮的研究和开发成为热点,市场前景非常广阔。传统的大豆异黄酮工业受含量低、提取纯化工艺和大豆原料本身的熟期限制,因此,通过非大豆提取途径获得大豆异黄酮成为大家研究的新方向。 本研究首先对转大豆异黄酮合成酶(isoflavone synthase)基因的乳酸乳球菌工程菌生长特性进行了研究,然后通过单因素试验和正交试验对影响乳酸乳球菌工程菌株发酵产大豆异黄酮的条件进行了优化,并对发酵底物原料进行了筛选和优化,对工程菌株的遗传稳定性作了初步考察。主要研究结果如下： 利用比浊法测定了工程菌株Lactococcus Lactis NZ3900/pNZ8149-IFS1的生长曲线,确定其在生长8-10小时后达到对数生长期末期。 对其在发酵过程中酸度的变化绘制了曲线,表明其在发酵过程中由于产酸,而使培养液的pH值下降,由最初的pH值7左右下降至4.8左右。 使用缓冲液调节培养基的初始pH值进行发酵,使菌体的对数生长期得到延长,发酵液pH值由于乳酸积累逐步下降的趋势得到缓解,最终仅降低约0.4个pH值单位。 通过单因素试验和正交试验优化了产大豆异黄酮的条件,确定了有利于大豆异黄酮产量的培养基组分：乳糖3%,大豆蛋白胨2%,酵母粉1%,磷酸氢二钠2%,硫酸镁0.4%,抗坏血酸0.1%；最适的培养条件：用0.2mol/L柠檬酸调节培养基的pH值为6.5,3%的接种量,在30℃静止培养4h后,加入终浓度为0.2mg/ml的底物柚皮素以及终浓度为10ng/ml诱导剂nisin,每分钟150转24℃继续培养20小时。在最佳培养基和最适发酵条件下,大豆异黄酮的产量达到12.5mg/L。 采用单因素试验筛选了工程菌株发酵产大豆异黄酮的底物,并最终选择了以植物材料1为原料,以蒸馏水为提取溶剂,以1：30的料液比,沸水浴中提取2小时,以提取液配制发酵培养基进行发酵,得到异黄酮的含量为6.6mg/L。 工程菌的遗传稳定性通过目的基因的PCR鉴定、重组质粒的酶切鉴定、SDS-PAGE和0、10、20、30、40和50代各代菌种发酵生产大豆异黄酮能力进行检测；通过复制平板计数法计算质粒的丢失率。结果表明,工程菌株重组质粒在50代内具有良好的遗传稳定性:的基因在50代内稳定表达；0、10、20、30、40和50代菌株发酵生产大豆异黄酮的能力没有显著差异；发酵培养基中乳糖的浓度对工程菌株的遗传稳定性有一定的影响,在乳糖使用量达到2%以上时,有利于重组质粒的稳定性。