钟基因Clockla在斑马鱼胚胎期双酚A暴露所致神经发育毒性中的作用

目的:采用clockla敲除(clockla-l-)斑马鱼胚胎模型,探讨钟基因clockla在斑马鱼胚胎期BPA暴露所致神经发育毒性中的作用及机制。方法:1.BPA胚胎期暴露半数致死浓度的确定在0、2.5、5、10 mg/L的BPA暴露下,统计斑马鱼胚胎72 h、96 h以及120 h的死亡率。根据寇氏改良法计算各个时间点的半数致死浓度(LC50),确定后续实验的暴露时间和浓度。2.荧光素酶报告基因实验构建包含或不包含斑马鱼clockla启动子区ERE序列的质粒,与ER共同转染293T细胞,12h后同时用1μM BPA或E2处理细胞,24h后裂解细胞测定荧光值。3.测定野生型(WT)和clockla-l-斑马鱼的胚胎畸形率,行为运动及细胞凋亡的变化显微镜下挑选健康的WT和clocka-l-斑马鱼受精胚胎,随机分组。在6 hpf(受精后6小时)时用0、1、5、25 μMBPA处理胚胎,96 h后,在体视显微镜下观察幼鱼,统计畸形率。清水冲洗三次后置于96孔板中,每孔一条。设置斑马鱼行为测定仪程序,连续监测幼鱼在光照或黑暗条件下的行为运动。胚胎暴露96 h后,吖啶橙染色20 min,PBS洗涤两次,荧光显微镜下观察鉴定凋亡细胞的分布变化。4.PI3K/AKT-Nrf2-ARE 通路相关基因(PI3k、AKT、Nrf2、Keapl、Nqo-1)表达变化的测定在6 hpf时用0、1、5、25μM BPA处理WT和clockla-l-斑马鱼胚胎,96 h后,将同一处理组幼鱼收集到一个EP管中,DEPC水洗涤两次,加入Trizol研磨提取RNA,RT-PCR检测各相关基因表达情况。结果:1.BPA与雌二醇作用类似,都可以通过与clockla启动子区的ERE序列结合,激活clockla的转录。2.不同浓度BPA对斑马鱼胚胎产生的影响不同:在中高浓度处理组中幼鱼畸形率升高,运动行为下降;高浓度处理组斑马鱼幼鱼体内凋亡细胞增多。钟基因clockla敲除的胚胎中,以上改变更加明显。3.BPA暴露后,斑马鱼PI3k/AKT-Nrf2-ARE通路及神经发育相关的基因表达发生改变。在野生型斑马鱼中,PI3k、AKT1、Nrf2和Nqo-1基因表达量在1μM浓度组升高,Nrf2和Keap1基因在在5μM浓度处理组表达增加。但在clockla敲除的斑马鱼中,只有Nrf2基因在25 μM处理组表达降低,其他基因表达均无明显变化。结论:1.BPA作为一种类雌激素的环境污染物,能够产生与雌二醇相似的作用,激活斑马鱼钟基因clockla的表达。2.BPA处理对clockla敲除斑马鱼胚胎的神经发育毒性更明显,提示该基因可起一定的保护作用。3.clockla发挥保护作用的机制之一,可能是通过激活下游的PI3k/AKT-Nrf2-ARE 通路实现的。