基于质量标志物T2、T5的冬虫夏草质量评价研究

冬虫夏草(Ophiocordyceps sinensis(Berk.)Sacc)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科幼虫或幼虫尸体形成的干燥复合体,主要分布于青藏高原地区,海拔高度2800米以上的高寒草甸和灌木地带为冬虫夏草的集中分布区域,具有调节免疫、降血脂、抗肿瘤、抗菌、抗疲劳等多种效用。目前市场上冬虫夏草混淆品较多,且多为虫草属近缘种,其性状与化学成分(腺苷、核苷等)与正品冬虫夏草相似度高,现有中国药典方法难以进行有效的鉴别,严重影响了临床用药的安全。有必要筛选冬虫夏草中的特异性成分作为质量标志物,制定更科学、合理的冬虫夏草的质量标准。本文通过制备色谱的方法分离提取出了冬虫夏草中的特异性成分T2和T5。通过方法学考察,T2、T5的制备方法简便、易行,能够有效的纯化、富集T2、T5。考察了T2、T5的稳定性,T2容易受到温度和空气的影响发生部分降解,在90℃的时候,降解产物为T4,70和50℃的时候降解产物为T3、T4,低温干燥时不发生降解;与空气接触会促进T2的降解反应。T5比较稳定,不会发生降解反应。确定了T2和T5的最佳干燥方法为冷冻干燥。运用UPLC-Q-TOF/MS的方法对T2、T5的化学结构进行了初步的研究,结果显示T2、T5很有可能是一种小分子的多肽。使用LC-MS/MS测序并验证,结果表明T2、T5就是小分子的多肽。具体方法如下:在正离子模式下,挑选一级质谱中强度排名前二十的碎片做二级质谱,所得的碎片信息使用MASCOT软件检索并与NCBI数据库进行比对,得到所有来源于冬虫夏草及其同属的蛋白、肽段序列的阳性结果。测序结果中排名最高的四个肽段序列,其中T2得分最高的两个肽段SVTDPFHPGGPGLIR、IILLILK来源于冬虫夏草,T5中ETGNLLR肽段来源于冬虫夏草,LLLALVK来源于冬虫夏草同属Ophiocordyceps unilateralis。课题组下一步的工作是从测序结果中筛选出得分最高的几个肽段SVTDPFHPGGPGLIR、IILLILK、ETGNLLR、LLLALVK,用色谱和质谱进行比对和验证,确定T2和T5的结构,最终建立基于T5的冬虫夏草质量控制的新方法,并对T2、T5的活性进行研究,以期对冬虫夏草的质量控制和功效说明作出贡献。