油茶种子油体蛋白基因的分离克隆及其原核表达

油茶是我国南方最重要的可食用木本油料树种。油茶种子油体蛋白对种子中油脂的储藏具有重要意义。近年来随着油体表达系统研究和发展，油体蛋白基因的分离克隆和表达的研究更是得到了广泛的重视。为了分离克隆油茶油体蛋白基因并将之发展成一种经济简单的蛋白表达纯化体系，我们特开展了本课题的研究。主要研究结果如下： 1)油茶种子油体蛋白的分离和鉴定 以成熟油茶种子为材料，利用油体在水相中离心漂浮特性，经反复洗涤和离心分离提取油茶种子油体，并检测不同pH条件下油体的稳定性，结果显示，当pH为6.2和6.8时，油体表面电荷被中和，油体间发生聚合，由此推测油茶油体等电点约在6.5左右。对油茶油体丙酮沉淀初提物中的蛋白组分进行SDS-PAGE分析，结果显示油茶种子中两类蛋白表达量较大，分子量约为14.4kDa和18.4kDa，与本文中油茶油体蛋白基因ORF分析推测的蛋白大小相近。同时也发现了其他少量的大分子量蛋白的存在，对这些蛋白的鉴定还有待进一步的研究。 2)油茶种子油体蛋白基因的分离克隆和生物信息学分析 利用EST技术、多序列比对和序列聚类等生物信息学方法分离筛选油茶种子cDNA文库中的油体蛋白基因。分离到的油茶油体蛋白家族基因可聚为5类，分别命名为：co_oleⅠ（包括A和B两个亚类）、co_oleⅡ、co_oleⅢ、co_oleⅣ和co_oleⅤ。将其与其他物种油体蛋白进行比较分析，结果表明：Co_oleⅠ、Co_oleⅣ和Co_oleⅤ属于高分子量（H）同型体，Co_oleⅡ和Co_oleⅢ属于低分子量（L）同型体。根据这些基因的ORF设计引物（分别含起始密码子和终止密码子）扩增了其基因组DNA序列，cDNA序列和基因组DNA序列的比较结果表明后者均不含有内含子，且两者也存在一定的差异。利用生物信息学方法对油茶油体蛋白结构域搜寻结果显示，油茶油体蛋白氨基酸序列中间部分存在若干跨膜结构，Co_oleⅡ的N端存在简单重复序列，Co_oleⅣ的C端含有一段转曲螺旋；理化分析结果显示油茶油体蛋白氨基酸序列中间部分均含有极强的疏水跨膜结构，两端均表现为疏水和亲水的两性区，与研究报道的油体蛋白三个结构区特性一致。二级预测结果显示油茶油体蛋白的C端含有较多的α—螺旋结构，N末端和中心疏水区以β—折叠为主，并含有