ERK信号通路与microRNA-133b-5p在吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用及其机制

背景与目的心力衰竭(心衰,heart failure,HF)患者在接受心脏或非心脏手术时,易发生围术期心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)损伤,是临床麻醉医师需要面对的一个棘手问题。本课题组前期研究发现,细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信号通路活化在吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)减轻离体心衰大鼠心肌I/R损伤中发挥重要作用。同时在心衰心肌细胞中miR-133b-5p下调最明显,且这种下调可被MPC所拮抗。Fas是miR-133b-5p的关键靶基因,MPC减轻心肌I/R损伤可能是通过上调mi R-133b-5p后抑制Fas介导的心肌细胞凋亡。受体相互作用蛋白(the receptor-interacting protein,RIP)是细胞应激的重要调节因子,与死亡域受体Fas相互作用,调控心肌细胞凋亡及坏死。鉴于以上研究背景,本研究进一步探讨ERK信号通路与mi R-133b-5p靶向调控Fas及RIP信号在MPC减轻心力衰竭大鼠心肌I/R损伤中的作用机制,以及两者之间的相互作用,为研究MPC在心力衰竭大鼠心肌保护机制中提供新的理论依据。方法1.在体水平健康成年雄性SD大鼠,200-230g,尾静脉注射盐酸多柔比星2mg/kg,1周1次,连续6周,制备慢性心力衰竭模型,在第8周末将造模成功的50只大鼠随机分为5组(n=10):(1)假手术组(Sham组)、(2)缺血再灌注组(I/R组)、(3)吗啡预处理组(MPC组)、(4)ERK抑制剂PD98059+吗啡预处理组(MPD组)、(5)PD98059对照组(PD组)。采用开胸结扎左冠状动脉前降支(LAD)缺血30 min、再灌注2 h的方法制备大鼠I/R损伤模型。除Sham组只缝线,不结扎LAD外,其余各组均进行LAD结扎。MPC组于缺血前股静脉输注吗啡0.1mg/kg,输注5 min后停止输注5 min,重复3次进行后进行I/R损伤。MPD组于吗啡预处理前15 min股静脉输注PD98059 0.5mg/kg至缺血开始后5 min,共50 min,然后制备I/R损伤模型。PD组持续输注0.5mg/kg PD98059至缺血开始后5 min,共50 min,然后制备心脏I/R损伤模型。以上各组分别于基础值、再灌注5和10 min时取静脉血测乳酸脱氢酶(LDH)活性;再灌注结束后TTC染色检测梗死区体积(IS)、缺血危险区体积(AAR)及IS/AAR比值;qRT-PCR检测miR-133b-5p及Fas;Western blot检测Fas、ERK、GSK-3β和RIP1/RIP3蛋白表达。2.心肌细胞水平乳鼠原代心肌细胞给予阿霉素处理24 h,采用随机数字表法将细胞分为7组(n=4):(1)空白组(Control组)、(2)缺氧复氧组(H/R组)、(3)吗啡预处理组(MPC组)、(4)miR-133b-5p过表达+缺氧复氧组(agomiR-133b+H/R组)、(5)过表达阴性对照+缺氧复氧组(agomiR-NC+H/R组)、(6)miR-133b-5p抑制剂+吗啡预处理+缺氧复氧组(ant-miR-133b+MPC组)、(7)抑制剂阴性对照+吗啡预处理+缺氧复氧组(ant-miR-NC+MPC组)。除Control组细胞正常培养外,其余各组均行缺氧4 h复氧2 h处理;MPC组细胞于缺氧前用含1mmol/L吗啡的培养液孵育10 min;agomiR-133b+H/R组和agomiR-NC+H/R组分别于H/R前24 h转染终浓度均为50 nmol/L的miR-133b-5p agomir或agomir-NC;ant-miR-133b+MPC组和ant-miR-NC+MPC组分别于MPC前24 h转染终浓度均为100 nmol/L的miR-133b-5p antagomir或antagomir-NC。各组按照上述处理结束后,采用CCK-8法测定细胞活力;LDH试剂盒测定细胞培养液中LDH活性;FITC Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡及坏死;qRT-PCR检测miR-133b-5p与Fas表达;Western blot检测Fas、ERK、GSK-3β和RIP1/RIP3蛋白表达。结果1.在体水平与I/R组比较,MPC组IS和IS/AAR减少,再灌注5和10 min时LDH活性降低,mi R-133b-5p、p-ERK1/2及p-GSK3β蛋白表达上调,Fas mRNA/蛋白及RIP1/3蛋白水平降低(P<0.05),AAR差异无统计学意义(P>0.05);与MPC组比较,MPD组IS和IS/AAR增加,再灌注5和10 min时LDH活性升高,miR-133b-5p、p-ERK1/2及p-GSK3β蛋白表达下调,Fas mRNA/蛋白及RIP1/RIP3蛋白水平增高(P<0.05),AAR差异无统计学意义(P>0.05),PD组差异无统计学意义(P>0.05)。2.心肌细胞水平与H/R组相比,agomiR-133b+H/R组和MPC组可显著增加心肌细胞活力,降低LDH活性及心肌细胞凋亡率/坏死率,显著上调mi R-133b-5p、p-ERK1/2及p-GSK3β蛋白表达,降低Fas mRNA/蛋白及RIP1/3蛋白水平,(P<0.05),而agomiR-NC+H/R组差异无统计学意义(P>0.05);与MPC组相比,ant-miR-133b+MPC组则显著降低了心肌细胞活力,增加心肌细胞培养液中LDH活性及心肌细胞凋亡率/坏死率,降低miR-133b-5p、p-ERK1/2及p-GSK3β蛋白表达水平,升高Fas mRNA/蛋白及RIP1/RIP3蛋白水平(P<0.05),而ant-miR-NC+MPC组差异无统计学意义(P>0.05)。结论吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤,其机制可能涉及ERK信号通路和miR-133b-5p靶向调控Fas,且两者间存在着相互作用,共同作用于下游的RIP信号。