吗啡预处理保护心力衰竭大鼠心肌细胞缺氧再给氧损伤的相关特异性microRNA的筛选验证及生物信息学分析

背景心力衰竭是各种心脏疾病发展的严重阶段，及时手术治疗是冠心病、心脏瓣膜病等所致心力衰竭患者延长生命、改善预后的关键，但这类患者更易发生围术期心肌缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, IRI），给麻醉安全和患者生命都带来严重威胁。本课题组发现经典的心肌保护措施缺氧预处理（Hypoxicpreconditioning, HPC）对心力衰竭心肌细胞缺氧再给氧损伤（Hypoxia-reoxygenationinjury, HR injury）的保护作用消失而吗啡预处理（Morphine preconditioning, MPC）的保护作用仍存在，其机制尚待阐明。MicroRNA(miRNA)是近年来新发现的一类小分子非编码RNA，参与调控心肌缺血再灌注损伤、缺血预处理的保护作用、心衰发展、阿片药理作用等多个过程，但miRNA是否介导MPC保护心衰心肌细胞缺氧再给氧损伤目前尚未见报道。本研究利用微阵列分析技术探索MPC对心力衰竭大鼠心肌细胞microRNA (miRNA)表达谱的影响并预测分析miRNA的靶基因及其功能。 方法选择健康成年雄性SD大鼠，尾静脉注射阿霉素制备慢性心力衰竭模型，分离心室肌细胞，制备心肌细胞MPC及HR损伤模型，本课题实验分为两部分完成。 实验一，miRNA芯片筛选。心室肌细胞随机分为3组：正常对照组（nCON）、心衰对照组（fCON）、心衰吗啡预处理组（fMPC）。各组处理后即刻收集细胞，提取总RNA行芯片分析检测miRNA表达谱的变化，重点比较fCON和fMPC组间差异表达的miRNA；TargetScan、miRanda软件预测差异表达miRNA的靶基因，GO（基因功能）和KEGG Pathway（信号通路）分析靶基因功能，构建miRNA-基因网络调控图，识别可能的核心miRNA及靶基因。实时定量PCR（quantitiverealtime PCR, qRT-PCR）法验证芯片结果。 实验二，根据生物信息学分析结果，选择miR-133b-5p为目的miRNA，进一步检测其靶基因Fas在心衰心肌细胞HR损伤中的表达变化及预处理的干预作用。正常和心衰心肌细胞分离后，分为4组：正常对照组（nCON）、心衰对照组（fCON）、心衰缺氧再给氧组（fHR）、心衰吗啡预处理组（fMPC+HR）。各组处理完毕后收集细胞提取RNA及蛋白，行qRT-PCR和Western blot检测靶基因Fas mRNA和蛋白表达水平。 结果 1. miRNA芯片分析结果miRNA芯片分析显示，与nCON组比较，fCON组有5个miRNA上调7个miRNA下调；与fCON组比较，fMPC组有8个miRNA上调10个miRNA下调（p<0.01，信号值>500）。其中miR-133b-5p、miR-6216、miR-664-1-5p、let7e-5p等miRNA发生了显著改变（Fold change>2）。miR-133b-5p在心衰心肌细胞（fCON vs. nCON）中显著下调，而经MPC处理后miR-133b-5p表达水平增加（fMPC vs. fCON）；miR-6216，let7e-5p在心衰心肌细胞中均显著上调，但经MPC处理后表达水平降低。miR-664-1-5p在心衰过程中差异无显著性，而fMPC处理后其表达显著下调。 2.靶基因生物信息学分析GO及KEGG Pathway分析发现fMPC诱导差异表达的miRNA所调控的靶基因主要与凋亡、钙稳态、MAPK信号通路等功能有关。miRNA-gene-network发现miR-133b-5p及Fas可能是介导凋亡的核心miRNA和靶基因，并发现Fas的3’UTR区域含有miR-133b-5p的特异性结合位点。 3. qRT-PCR验证芯片结果qRT-PCR结果显示在nCON、fCON、fMPC三组中miR-133b-5p、miR-6216及let7e-5p的表达水平和变化趋势与miRNA芯片分析结果一致。 4. miR-133b-5p的靶基因Fas在心衰心肌细胞HR损伤中的表达及MPC的干预作用qRT-PCR结果显示，与nCON组比较，fCON组Fas mRNA表达增加，与fCON比较，fHR组Fas mRNA表达下调，而fMPC+HR组较之fHR组则进一步下调（p<0.01）；Western blot结果显示，与nCON组比较，fCON组Fas蛋白表达亦显著增加，不同于mRNA表达，fHR组与fCON组比较Fas蛋白表达进一步增加，而fMPC+HR组较之fHR组则降低（p<0.01）。从各组Fas蛋白表达的变化趋势，我们发现miR-133b-5p和Fas蛋白存在一种反向调节的关系。 结论MPC对心衰心肌细胞miRNA表达谱产生影响，其中miR-133b-5p、miR-6216、let7e-5p改变最为显著；差异表达miRNA调控的靶基因功能主要集中于凋亡、钙稳态以及MAPK信号通路；miR-133b-5p可能通过其靶基因Fas介导MPC对心力衰竭心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用。