胰岛素诱导基因（Insig2）在调控脂肪细胞分化与脂肪合成中作用的研究

第一部分葡萄糖浓度对3T3-L1细胞分化及insig-1和-2 mRNA表达的影响 目的胰岛素诱导基因（insig）是近年来发现的新基因，在脂质合成与脂肪细胞的分化中发挥着重要的调控作用。观察不同葡萄糖浓度对3T3-L1细胞分化及insig-1，-2 mRNA表达的影响，探讨insig在脂肪细胞分化与脂肪代谢中的作用。 方法将3T3-L1细胞分别在不同葡萄糖浓度（5.5mol／L和25mol／L）培养液中诱导分化，用油红“O”染色、RT-PCR和原位杂交技术检测脂肪细胞的分化、insig-1，-2 mRNA及脂肪细胞脂肪酸结合蛋白（AP2） mRNA的表达。 结果：随着3T3-L1细胞的分化，insig-1，-2 mRNA、AP2 mRNA表达逐渐上调；但低糖诱导组的细胞分化程度显著低于高糖诱导组；低糖诱导组的insig-1，-2 mRNA表达较高糖诱导组明显增高（P＜0.05），而AP2 mRNA表达较高糖诱导组明显降低（P＜0.05）。 结论在3T3-L1细胞分化过程心中，insig基因表达逐渐上调，低糖时insig的表达上调更明显，此可能与低糖时脂肪细胞分化及脂质沉积相对受抑制有关。 第二部分insig-2过表达对3T3-L1前脂肪细胞分化与相关基因的影响 第一章EGFP-C3-insig-2和pcDNA3.1（+）-insig-2真核表达质粒的构建及insig-2的亚细胞定位 目的构建EGFP-C3-insig-2和pcDNA3.1（+）-insig-2融合基因真核表达质粒，探讨insig-2基因的亚细胞定位与表达，以及稳定转染的3T3-L1细胞insig-2过表达对前脂肪细胞分化的影响。 方法采用RT-PCR法从3T3-L1细胞获取小鼠的全长insig-2基因，经T载体克隆、鉴定后，分别克隆入真核表达载体pEGFP-C3及pcDNA3.1（+）中。酶切、测序对插入片段进行分析和鉴定后，用脂质体转染法将带绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-C3瞬时转入3T3-L1细胞，通过荧光显微镜、RT-PCR检测其在3T3-L1细胞中的表达、定位及下游基因AP2 mRNA的变化。 结果：酶切、测序鉴定所插入片段的大小和基因序列准确无误，成功构建了重组质粒pEGFP-C3-insig-2和pCDNA3.1（+）-insig-2融合基因真核表达载体。pEGFP-C3-insig-2真核表达载体瞬时转染3T3-L1细胞后，该融合蛋白在转染的细胞胞浆中表达；insig-2基因的转录明显增强，而其下游基因AP2 mRNA表达明显下调。 结论：insig-2蛋白在3T3-L1细胞中定位于胞浆，过表达时影响其脂肪代谢。 第二章insig-2基因稳定转染对3T3-L1细胞分化和脂质合成的影响 目的：研究pCDNA3.1（+）-insig-2稳定转染3T3-L1细胞后insig-2基因过表达在3T3-L1脂肪细胞分化和脂肪形成中的作用。 方法：用脂质体转染法将重组质粒pCDNA3.1（+）-insig-2稳定转染3T3-L1细胞。转染后，分别用流式细胞仪检测pCDNA3.1（+）-insig-2转染组、pCDNA3.1（+）空质粒组及未转染的3T3-L1细胞（空白对照组）的细胞周期与凋亡率；用油红“O”染色鉴定分析细胞的诱导分化；用半定量RT-PCR测定各组3T3-L1前脂肪细胞及分化过程中insig-2、insig-1、固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding proteins SREBPs）、SREBP裂解活性蛋白（cleavage-actiwating protein SCAP）、脂肪酸合成酶（FAS）、AP2基因的mRNA表达；用免疫组织化学法检测细胞转染后的insig-2蛋白表达。 结果：半定量RT-PCR检测和免疫组化分析结果显示，insig-2 mRNA及蛋白表达较转染前及空质粒转染组、空白对照组均显著增加，提示pCDNA3.1（+）-insig-2成功转染的3T3-L1细胞呈高效表达，但对其前体细胞的细胞周期及凋亡率无明显影响；诱导分化后的第6和12天，pCDNA3.1（+）-insig-2转染组的成熟脂肪细胞明显少于两个对照组，且分化过程中三组细胞生长曲线无明显差异。转染后的3T3-L1前脂肪细胞insig-2相关基因insig-1、FAS、AP2、SREBPlc mRNA均表达下调；随着细胞的分化，上述基因mRNA表达均上调，但pCDNA3.1（+）-insig-2转染组的insig-2较其他两个对照组显著上调，而FAS和AP2 mRNA明显下调。 结论：转染后insig-2高表达抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化及脂质合成相关基因表达。 第三章insig-2基因过表达对3T3-L1脂肪细胞脂联素表达的影响 目的：脂联素对糖代谢、脂代谢和能量平衡的调控有重要作用。观察pCDNA3.1（+）-insig-2转染后3T3-L1前脂肪细胞脂联素mRNA表达及其分化过程中的脂联素分泌，探讨insig基因过表达对脂肪细胞脂联素分泌的影响。 方法：以转染pCDNA3.1（+）及未转染的3T3-L1细胞为对照组，半定量RT-PCR检测pCDNA3.1（+）-insig-2转染后24 h和72h 3T3-L1前脂肪细胞的脂联素mRNA表达。用ELISA法测定转染后3T3-L1前脂肪细胞及其在诱导分化过程中的脂联素动态变化。 结果：3T3-L1前脂肪细胞pCDNA3.1（+）-insig-2转染后，脂联素mRNA的表达量明显降低；3T3-L1前脂肪细胞的脂联素分泌较对照组明显降低（P＜0.05）；在诱导分化的第0～4天，三组的脂联素下降无明显差异，但此后其分泌逐渐升高，转染组较其他两个对照组明显降低（P＜0.05）。 结论：转染后insig-2过表达抑制3T3-L1脂肪细胞脂联素mRNA和蛋白的表达。