乙酰胆碱酯酶抑制法快速检测蔬菜农药残留技术的研究

本研究用家蝇（Musca domestica Vicina L.）敏感种群和抗性种群对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的敏感度进行了比较；研究了敏感家蝇幼虫、蛹、成虫体内乙酰胆碱酯酶（AChE）比活力的差异，并对成虫羽化后不同天数其头部AChE的比活力、敏感度以及酶源蛋白质含量的变化，以及缓冲液pH值对家蝇头部AChE比活力的影响进行了测定，对该酶源直接用于农药残留检测的条件进行了优化；并用该酶对目前害虫防治中常被乱用或滥用的有机磷和氨基甲酸酯类药剂的灵敏度、最小检出浓度、在蔬菜上的回收率等进行了测定，并与国家标准方法——色谱法进行了比较，明确了酶抑制法在农药残留速测中的优缺点。结果表明： 1. 家蝇抗性种群和敏感种群对有机磷和氨基甲酸酯类药剂的敏感度测定结果表明：家蝇抗性种群已对敌敌畏和丁硫克百威产生了较高的抗性，敌敌畏和丁硫克百威对抗性种群的致死中浓度（LC50）分别是敏感种群的12.90倍和10.26倍；对抗性种群的抑制中浓度（I50）分别是敏感种群的7.99倍和3.60倍。因此，酶抑制法测定农药残留中的酶源应从家蝇敏感种群中提取。 2. 家蝇成虫头、胸、腹三部分以及不同虫态AChE的比活力测定结果表明：家蝇成虫头、胸、腹三部分，头部AChE的比活力最高，分别是胸部和腹部的5.4倍和17.5倍，表明家蝇成虫AChE的活性主要集中于头部；雄成虫头部AChE的比活力要高于雌成虫、幼虫和蛹，其AChE的比活力分别是幼虫、蛹、雌成虫的22.9、64.9和1.2倍。同时，在试验过程中发现，从家蝇成虫头部制备AChE要比胸部和腹部容易，而且雌成虫的获得要比雄成虫容易，因此在利用家蝇AChE进行农药残留研究时，建议最好以成虫头部为材料，且不必区分雌蝇和雄蝇。 家蝇羽化后不同天数其头部AChE的比活力、酶源蛋白质的含量、AChE的敏感度的变化，以及在不同缓冲液pH条件下AChE比活力的测定结果表明：家蝇初羽化至羽化后第15d，其头部AChE的比活力逐渐升高（0.4483±0.0104～0.7769±0.0189μmol/mg?min），而酶源蛋白质的含量逐渐下降（187.0222±9.0213～83.0222±7.1111μg/头）。羽化后2～4d，其头部AChE的敏感度最高；初羽化和羽化后第15d，敌敌畏的I50分 3. 别是羽化后第3d的1.4倍和2.1倍。在一定的pH值范围内（6.6～8.0），家蝇头部AChE的比活力随缓冲液pH值的升高而增大。因此，制备酶源时应选择羽化后2～4d（3～5日龄）的家蝇，同时因大多数有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂在碱性条件下易分解，所以在测定中所使用的缓冲液的pH值不宜过高，以7.0～7.6为宜。 4. AChE抑制法对有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏度和最小检出浓度测定结果表明：各种农药因其化学结构和作用机理不同，对AChE的抑制能力也不相同。在所测定的杀虫剂中，氧化型有机磷的抑制能力较强，AChE抑制法对其的灵敏度较高，最小检出浓度较低；而硫代型有机磷的抑制能力较差，最小检出浓度较高，但辛硫磷因为含有肟基，选择毒力大大增强， 最小检出浓度较低；AChE抑制法对氨基甲酸酯类农药克百威、灭多威的灵敏度较高，最小检出浓度较低；而对涕灭威的灵敏度较低，最小检出浓度较高。 5. AChE抑制法对有机磷和氨基甲酸酯类农药的回收率测定结果表明：AChE抑制法对13种有机磷和氨基甲酸酯类农药的平均回收率都较高，符合农药残留分析的要求。 6. AChE抑制法监测几种有机磷和氨基甲酸酯类农药在蔬菜上的消解情况表明: 若以酶抑制率15%为判定标准，用AChE抑制法检测蔬菜上农药残留，检验呈阴性反应的样本一般来说是比较安全的，呈阳性反应的样本，其杀虫剂残留量大多已超过现行最大允许残留限量标准。 7. AChE抑制法与经典方法——色谱法的比较结果表明：AChE抑制法与经典方法相比的优点是操作简单，测定所需的时间短，不需要贵重的仪器，费用较低，适合于现场的快速检测。AChE抑制法虽然在回收率、精密度上较经典方法差一些，但可以满足半定量的要求，适合于我国的小规模、分散式的农产品生产与经销体系。