BM-MSC诱导移植免疫耐受和修复慢性移植肾损伤的初步研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞(BM-MSC)分离、纯化和细胞鉴定的方法和超顺磁氧化铁(SPIO)标记BM-MSC方法的安全性及可行性,分析BM-MSC在体内分布与细胞输注途径的关系,以确定BM-MSC的最佳输注途径。 方法：取西藏小型猪骨髓,采用密度梯度离心法对骨髓间充质干细胞进行分离和纯化,观察其生长曲线。对所获取的细胞进行成脂、成骨诱导分化,并应用流式细胞术检测细胞表面标志物CD45/CD90/CD105,以鉴定所纯化细胞是否为BM-MSC。应用SPIO对BM-MSC进行体外标记,用MTT法检测不同浓度SPIO对标记后细胞活力和增殖能力的影响。建立西藏小型猪同种异体肾移植模型,分别经移植肾动脉和经髂总静脉输注SPIO标记的BM-MSC,切取受体猪各器官,通过普鲁士蓝染色和透射电镜观察标记的BM-MSC在移植肾、肺脏及其他器官的分布情况。 结果：应用梯度密度离心法可获取高纯度的BM-MSC,细胞具有良好的生长活力和传代能力。BM-MSC可经诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,应用茜红素和油红O染色可检测出细胞中钙结节和脂肪颗粒；经流式细胞术检测细胞表面标志物CD90阳性率为96.9%,CD105阳性率为95.7%,CD45阳性率为1.1%(阴性)。SPIO对BM-MSC的标记率接近100%,通过MTT法检测25ug/ml的SPIO对BM-MSC的增殖能力影响较少、又可有效标记细胞是比较适宜的标记浓度,50ug/ml的SPIO标记细胞2天后细胞活性减退。透射电镜可观察到BM-MSC细胞内小囊泡包含的高密度铁粒子。采用供肾动脉与髂总动脉、供肾静脉与髂总静脉端侧吻合的方式成功建立西藏小型猪肾移植模型,将标记的BM-MSC分别经移植肾动脉和髂总静脉输注后,观察BM-MSC在受体猪体内分布显示：经移植肾动脉输注组,BM-MSC在移植肾内定植的细胞数明显多于经髂总静脉输注组,且存在统计学差异；经髂总静脉输注组,肺内的细胞数增加,有统计学差异。两种输注途径均未发生血管栓塞、感染等并发症。 结论：采用密度梯度离心法可获取高纯度、生长活力良好的BM-MSC;利用细胞外形特征、诱导定向分化和细胞表面标志物可成功鉴定BM-MSC;应用SPIO标记BM-MSC的方法简便可行,易于细胞在体内示踪；经移植肾动脉输注BM-MSC是安全和理想的输注途径,有利于BM-MSC在移植肾内定植、分化。 目的：通过对亲属活体肾移植受者输注自体间充质干细胞联合应用低剂量FK506进行免疫诱导,观察移植术后受者的移植肾功能、淋巴细胞亚群及比例和急性排斥反应发生率等指标,探讨自体骨髓间充质干细胞诱导移植免疫耐受的效果及其作用机制。 方法：随机选择2009.9-2012.9在我中心拟行亲属活体供肾移植的慢性肾功能不全(尿毒症期)患者,按照纳入标准入组,分为不输注自体BM-MSC的对照组(10例)和输注白体BM-MSC的实验组(10例)。实验组在术前1月行自体骨髓间充质干细胞制备,分别在术中、术后1周和术后1月共3次输注自体BM-MSC。首次在术中经移植肾动脉输注,细胞数5×106；术后1周和1月经外周静脉输注,细胞数1×106/kg/次。对照组FK506初始剂量为0.08mg.kg-1.d-1,实验组FK506初始剂量为0.04-0.05mg.kg-1.d-1,吗替麦考酚和强的松用量两组相同。术后动态观察移植肾功能、24小时尿蛋白、淋巴细胞计数和比例,应用流式细胞术检测淋巴细胞亚群及比例,并行程序性移植肾穿刺活检,以观察急性排斥反应的发生率等。 结果：采用梯度密度离心法可获取高纯度BM-MSC,其细胞表型为CD44+CD29+CD105+CD48+CD34+。20例受者手术成功,术后未发生移植肾动静脉栓塞、DGF、感染、GVHD等并发症。对照组中1例在移植术后7天发生急性血管性排斥反应并移植肾破裂,实验组未发生急性排斥反应。实验组与对照组均可维持良好的移植肾功能(Cr和Ccr)；实验组在术后早期(1周)24小时尿蛋白定量为308.1+55.1mg,低于对照组727.2±178.1mg, P<0.05,有统计学差异；实验组与对照组淋巴细胞计数和比例、NK细胞的比例、T淋巴细胞亚群CD3+CD4+、CD3+CD8+的计数和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、Treg细胞的比例在术后各时间观察点(术后1周、1月、3月和6月)均无统计学差异,P>0.05。 结论：自体骨髓间充质干细胞联合低剂量FK506能获得理想的移植肾功能,在早期可促进移植肾急性损伤的修复；可获得有效的免疫抑制效果,对淋巴细胞计数和比例、NK细胞的比例、T淋巴细胞亚群计数及比值达到有效调节；可以上调Treg细胞的比例,在一定程度上诱导移植免疫耐受。 目的：通过对慢性移植肾肾病(CAN)的患者输注骨髓间充质干细胞(BM-MSC),观察移植肾功能和移植肾间质纤维化等指标的变化,探讨BM-MSC对慢性移植肾肾病患者移植肾功能的影响和修复慢性移植肾损伤的机制。 方法：选择2009.12-2012.6确诊为慢性移植肾肾病且符合纳入标准的的患者10例,制备第三方健康骨髓间充质干细胞,予CAN患者共三次输注BM-MSC,输注时间为0天、7天和1月。首次在DSA引导下经移植。肾动脉输注,细胞数1.0×106/kg；第2、3次经外周静脉输注,细胞量为5.0×106/kg。临床观察指标包括：Cr、BUN、Ccr、24小时尿蛋白、血/尿β2微球蛋白。在治疗前和治疗后6月行移植肾活检,应用JD图像分析系统检测肾间质纤维化指标(LN、FN、TGF-β、 CTGF)的变化。 结果：除1例患者在第2次输注BM-MSC时出现过敏反应外,未发生出血、移植肾动脉栓塞、假性动脉瘤和感染等与BM-MSC输注相关的并发症。移植肾功能Cr和BUN在治疗前为203.7±46.4umol/L、15.43±8.46mmol/L,治疗后1周、1月分别为185.5±46.2umol/L,12.15±4.96mmol/L和172.6umol/L、11.76±5.12mmol/L,与治疗前比较有下降,差异有统计学意义,P<0.05；而3月及以后的移植肾功能Cr、BUN与治疗前比较,差异无统计学意义。Ccr在治疗后7天、1月、3月分别为43.18±18.04ml/min,43.18±18.04ml/min,48.04±22.34ml/min,较治疗前38.01±12.96ml/min增加,差异有统计学意义,P<0.05。治疗后1月24小时尿蛋白定量为478.5±289.3mg,较治疗前(105.6±327.3mg)减少,差异有统计学意义,P<0.05；治疗后3月及以后则无统计学差异。肾间质纤维化指标FN、LN在治疗6月后的平均光密度值为(0.174±0.027,0.199±0.015)与治疗前(0.182±0.019,0.212±0.013)相比有下降,但差异无统计学意义,P>0.05; TGF-β和CTGF在治疗6月后的平均光密度值为(0.16±0.015,0.139±0.025)与治疗前(0.212±0.017,0.192±0.010)相比有下降,且差异有统计学意义,P<0.05。 结论：慢性移植肾肾病在接受BM-MSC治疗后,血肌酐和尿素氮在1月内均有降低,内生肌酐清除率在3月内有所增加；24小时尿蛋白定量在1月内有所减少；肾间质纤维化相关的指标TGF-β和CTGF的表达减少。