海带（Laminaria japonica Aresch）多酚的提取、分离及其抗肿瘤、抗菌活性研究

植物多酚与人类的生活息息相关,作为一类具有多种生物活性的天然物质,它对人的消化、营养、健康产生影响,已在食品、药品、化妆品等工业中得到了广泛的应用。本论文以鲜海带(Laminaria japonica Aresch)为原料,系统地研究了海带多酚(KP)的制备、分离纯化、抗肿瘤、抑菌活性,并初步探讨了其理化性质和作用机理,为深入研究海藻多酚提供了基础数据,同时也为海带的高值化利用及新的抗肿瘤药物、食品保鲜剂的开发提供一种新的思路。 本论文的研究内容包括以下6个部分: 1.海带多酚提取率测定方法的选择: 海带可以综合利用提取多酚和其它副产物。通过酒石酸铁比色法和Folin-Denis法两种多酚定量分析方法的比较,表明以没食子酸丙酯为参照物的酒石酸铁比色法方便、快速、可靠,可以作为本次实验定量分析手段。另外,在同样的提取条件下,鲜海带总酚含量要比干海带的总酚含量略高。 2.海带多酚提取工艺条件的优化: 采用鲜海带为原料,以超声波、微波复合浸提为前处理手段,以多酚的提取率为指标,在单因素实验的基础上采用正交实验对KP浸提工艺参数进行了优化,结果表明:采用料液比1:7(g/mL),乙醇浓度85%,浸提温度70℃,浸提次数2次,浸提时间4h,提取效果最佳,KP提取率为2.08%。 3.海带多酚粗提物抗肿瘤、抗菌活性的研究: 以MTT法分别测定了KP粗提物对人肺腺癌A549细胞、鼠白血病P388细胞、人肝癌BEL-7402细胞和人宫颈癌Hela细胞的抗肿瘤活性;以平板打孔抑制法分别测定了KP粗提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾志贺菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、白色念珠菌、青霉、灰霉、黄曲霉的抑菌活性。结果表明:KP粗提物具有一定的抗肿瘤活性,在100μg/mL时,对A549、P388、BEL-7402、Hela细胞的抑制率分别为27.40±4.71%,43.44±1.86%,30.20±1.16%,29.68±2.61%。镜检发现细胞形态都发生不同程度的变化。肿瘤细胞的生长抑制活性量效关系表明KP对P388的IC50为120μg/mL,对BEL-7402的IC50大于200μg/mL,细胞毒作用呈剂量和时间依赖性,对P388的抑制活性要高于对BEL-7402的抑制活性。抑菌实验也显示KP具有广谱抗微生物性能,对供试的2种革兰氏阳性菌和5种革兰氏阴性菌都有一定程度的抑制活性,量效关系均呈剂量依赖型,最小抑菌浓度(MIC)为10μg/mL～40μg/mL。另外,多酚对革兰氏阴性细菌中的大肠杆菌、绿脓杆菌抑制效果较明显,对真菌如青霉、白色念珠菌亦有抑制作用。 4.海带多酚的分离纯化及其各部分活性检测: 利用有机溶剂萃取分离、AB-8大孔树脂吸附分离、SephadexLH-20凝胶层析等技术对KP进行分离纯化,最后得到4个峰组分,分别为A1、A2、B1、B2,并筛选出了具有较高活性的多酚组分。各组分肿瘤抑制活性大小依次为:A2 > A1 > B2 > B1,浓度为70.42μg/mL时,组分A2对BEL-7402和P388的抑制率分别为61.96±7.02%,40.47±8.70%;各组分的抑菌活性大小依次为:A2 > B2 > A1 > B1,在酚浓度为70.42μg/mL、45.68μg/mL的条件下,对4种菌均有抑制效果且比粗提物和树脂分离产物同等浓度下抑菌圈直径大。 5.海带多酚理化性质初步研究: 对KP的物理化学性质如溶解性、折光率、特征显色反应、pH稳定性、热稳定性及光谱特征进行了初步研究。结果表明:KP易溶于中极性溶剂,而在非极性溶剂和极性溶剂中溶解性较差;在不同溶剂中的折光率大小依次为乙酸乙酯>乙醇>丙酮>甲醇>水>氯仿=乙醚;特征显色反应表明KP具有酚类物质的共性。另外,KP在pH2.0～11.0和40～100℃的范围内都有肿瘤抑制活性,具有良好的pH稳定性和热稳定性。组分A2与PG、间苯三酚的紫外吸收谱图具有相似之处。组分A1、A2、B2与PG、连苯三酚的红外谱图都具有明显的酚羟基伸缩振动;都有芳香环骨架伸缩振动;在指纹区都有酚的特征吸收峰,在官能团区也较为相似,初步推断KP具有PG或连苯三酚相近或相似的结构。 6.海带多酚的抗肿瘤活性和抗菌活性机理初步探讨: 以显微镜观察药物处理前后细胞的形态变化,考察了多酚对自由基、致癌物的清除能力;以流式细胞术分析了多酚对肿瘤细胞的凋亡率及对细胞增殖周期的影响,并测定了菌体系统的紫外吸收变化。结果表明:KP处理P388和BEL-7402细胞48h后,镜检细胞形态发生较大变化,与正常对照组差异显著;在100μg/mL的浓度下,KP具有一定的清除自由基和致癌物的活性,对·OH、O2·-、NO2-清除率分别为75.37±5.68 %、55.48±4.35%、50.51±6.46%。流式细胞术表明多酚对P388肿瘤细胞的凋亡率及细胞增殖周期存在影响,其中A2组分凋亡峰极为显著。加入多酚的菌悬液280nm处的吸光度均明显增高,且对革兰氏阴性菌更为明显。