苹果酸-乳酸酶高活性菌株的筛选及酿造学特性研究

本研究在课题组前期构建的菌株分离筛选体系基础上，重点对我国宁夏葡萄酒主产区葡萄酒自然优良变异的苹果酸-乳酸菌进行筛选和利用。通过筛选酿造学特性优良、具有高苹果酸-乳酸酶活性的菌株，并对分离株进行了系统鉴定，以期为生产提供优良的发酵菌株。通过研究得出以下结论： 1．在2002、2003两个葡萄年份对我国宁夏葡萄酒主产区的苹果酸-乳酸菌进行了分离和筛选。通过考查分离菌株苹果酸-乳酸发酵性能、发酵适应性及发酵特性后，对鉴定为酒类酒球菌的12株菌株进行了pH、SO2和酒精等因素耐受性试验，然后再选择抗性较好的初选菌株进行苹果酸-乳酸酶活力测试。结果表明，分离菌株N7-03具有较强的苹果酸-乳酸酶活力[117.05mg苹果酸/log(cfu/ml)]，进一步的研究表明，N7-03具有良好的酿造学适应性。 2．通过对N7-03个体形态特征和菌落形态特征观察和Gram染色、过氧化氢酶反应、生理生化特性及苹果酸-乳酸酶基因（mle）的测序等鉴定指标分析表明，分离菌株N7-03为酒类酒球菌（O.oeni N7-03）。 3．利用PCR方法从酒类酒球菌N7-03基因组中扩增出651 bp的DNA片段，将之克隆到pUC19-T载体上并转化大肠杆菌（E. coli）JM109菌株。重组质粒的测序结果表明，克隆到了苹果酸-乳酸酶基因（mle），它含有527bp 的阅读框架，其核苷酸序列与国外文献报道相同。 4．采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）研究了N7-03进行苹果酸-乳酸发酵对赤霞珠干红葡萄酒风味影响。结果表明葡萄酒苹果酸-乳酸发酵前后风味成分主要包括有机酸类、酯类、酚类、杂环类以及高级饱和或不脂肪酸、呋喃羧酸、挥发性酚、吲哚醇和香荚兰醇等。其中，2-甲基-1-丙醇、乙酸乙酯、3-甲基-1-丙醇、2,3-丁二醇、2-羟基丙酸乙酯、苯乙醇、丁二酸二乙酯、乙基-氢化琥珀酸和4-羟基苯甲醇等成分构成了葡萄酒的主体香气，这些主体香气与其他风味成分一起构成葡萄酒的典型风味特征。苹果酸-乳酸发酵只对葡萄酒的风味具有修饰作用。 商业发酵剂与N7-03在苹果酸-乳酸发酵后的主体风味物质的种类与含量变化不大，仅在微量成分上存在细微差异，苹果酸-乳酸发酵后，葡萄酒风味特征极为相似。这也表明，N7-03是一株发酵风味特性优良的菌株，具有良好的商业应用潜力。