中国优良酒类酒球菌（Oenococcus oeni）的分离筛选及苹果酸—乳酸发酵研究

本文通过对酒类酒球菌分离培养条件的选择，建立了酒类酒球菌的分离培养体系，并对我国 葡萄酒主产区的苹果酸—乳酸菌进行分离和鉴定，从中筛选出了酿酒适应性和酿酒特性优良的菌 株。本文同时还对葡萄酒苹果酸—乳酸发酵过程中环境条件对细菌生长的影响、葡萄糖/苹果酸代 谢规律以及能量代谢等方面的内容进行了研究，结果表明： 1．在ATB、MRS、Rogos等10种培养基中，ATB和改良MRS培养基的RDF值（相对鉴别 力）最高，放线菌酮和山梨酸均能抑制酵母菌的生长，万古霉素能够抑制乳杆菌属细菌的生长。 酒类酒球菌的分离培养基配方为：ATB培养基+50mg/L放线菌酮+50mg/L万古霉素或MRS培养 基+10％番茄汁+50mg/L放线菌酮+50mg/L万古霉素，25～30℃厌氧（N2）培养； 2．采用酒类酒球菌分离培养基从我国不同生态带葡萄酒产区的葡萄酒中分离得到24株苹果 酸—乳酸菌。通过对其培养特征、形态学特征、苹果酸分解实验、过氧化氢酶实验、生理生化鉴 定（碳源产酸、石蕊牛奶实验、番茄汁生长因子依赖性、低pH抗性和酒精抗性实验等）进行考 查后表明，分离菌株均为酒球菌属细菌（酒类酒球菌）。 3．采用全细胞可溶性蛋白电泳技术与随机扩增多态性DNA（RAPD）技术对分离菌株进行 区分，结果表明，全细胞可溶性蛋白电泳图谱可以进行苹果酸—乳酸细菌的种间区分，但不能用 于酒类酒球菌菌株间的区分；RAPD图谱可以较好的用于酒类酒球菌菌株间的区分； 4．通过对酒类酒球菌11个随机引物共113个条带的相似性进行UPGMA聚类分析表明，从 我国不同生态区来源的酒类酒球菌可以分为两个亚群，这与前人的研究结果相似； 5．对分离菌株的酿酒适应性（对低pH、酒精含量和SO2的抗性）进行了系统研究，结果表 明，不同菌株间的酿酒适应性存在着很大的差异。其中，O.oeni SD-2a比商业菌株O.oeni 31DH 的适应性更强，此外，O.oeni SD-1b、O.oeni SD-2i和O.oeni SD-2h也有较好的酿酒适应性； 6．对优选菌株的酿酒特性进行了考查，结果表明，不同菌株间的苹果酸—乳酸酶活力也存 在着较大的差异，其中O.oeni SD-2h和O.oeni SD-2a，具有较高的MLA； 7．考查4株优选细菌对葡萄酒苹果酸—乳酸发酵前后游离氨基酸含量变化的结果表明，苹 果酸—乳酸发酵后，酒中总的游离氨基酸含量上升，其中Ser， Glu，Lys和Arg含量的升幅较大； 8．对苹果酸—乳酸发酵过程中苹果酸/葡萄糖代谢规律进行了研究发现，苹果酸/葡萄糖共存 时，细菌对两者的代谢受pH的调控，低pH值（3.2-3.5）条件下，细菌优先分解苹果酸，随着 pH值的升高，细菌对葡萄糖的分解速度加快，进一步研究表明，低pH值（3.2-3.5）条件下，细 菌的糖代谢活动受到抑制，此时，细菌主要通过分解苹果酸获取能量的，这也证明酒类酒球菌进 行苹果酸—乳酸发酵的目的性是为了在胁迫条件下获取能量，而不是为了提高生活环境的pH值。 9．采用荧光素-荧光素酶法对苹果酸—乳酸发酵过程中的ATP产生情况进行了分析，结果表 明，酒类酒球菌代谢苹果酸产生ATP受ATPase抑制剂和离子通道剂的抑制，这表明细菌利用苹 2 中国优良洒类酒球自（enococon cent）的分离筛边及苹果酸．乳酸发卜研究 摘要 果酸代谢产生能量时需要维持跨膜质于梯度（凸pH），并需要ATPase的参与。因此细菌是利用化 学渗透机制利用苹果酸产生能量的。 通过对分离菌株酿酒适应性和酿酒特性的综合评价，O cent SryZa是比商业菌株 O cent 31 DH更加优良的囱株．