目的:化痰活血这种治法常用于临床,梓醇是化痰活血方地黄的有效成分之一,本课题组前期研究发现化痰活血方和梓醇对哮喘小鼠有一定治疗作用,其机制可能通过干预Notch信号的转导,抑制哮喘哮喘小鼠中Th2细胞的异常活化,调节哮喘中Th1/Th2失衡,增加γ干扰素(INF-γ)分泌,减少白介素4(IL-4)和白介素17A(IL-17A)在哮喘小鼠肺泡灌洗液中的分泌。本次研究旨在探讨化痰活血方和梓醇拮抗哮喘小鼠炎症和黏蛋白MUC5AC的作用机制。体外细胞水平研究梓醇对刺激剂EGF诱导的16HBE细胞上清液黏蛋白MUC5AC的影响。方法:1.采用多次腹腔注射并雾化激发卵清白蛋白(OVA)的方式建立小鼠哮喘模型。实验第1、8、15d腹腔注射OVA,第21d起用2%OVA雾化激发,连续雾化7d的方式建立哮喘模型。实验9d起至第27d,分别灌胃化痰活血方和梓醇进行干预,第28d取样观察化痰活血方和梓醇对哮喘小鼠炎症和黏蛋白MUC5AC的影响。实验雾化期间,第25、26、27d观察小鼠的整体状况并记录引喘潜伏期;2.哮喘小鼠末次激发24h后,肺功能仪测定气道阻力(RI);3.病理切片HE、PAS染色观察肺组织病理变化和杯状细胞增生的情况;4.BALF沉淀用细胞涂片瑞氏吉姆萨染色检测炎性细胞的变化;5.酶联免疫法(ELISA)检测BALF中IL-5、MUC5AC、IL-10和TGF-β1含量的变化;6.MTT法检测梓醇对刺激剂EGF诱导的16HBE细胞株活性的影响;7.ELISA检测梓醇对16HBE细胞上清液中MUC5AC的影响;结果:1.雾化吸入OVA后,除正常组外,模型组小鼠出现头、鼻部瘙痒、呼吸急促、毛发竖起、活动量减少等表现,多次激发后,小鼠出现体重下降、毛发杂乱无光泽等症状,给予化痰活血方和梓醇干预后上述症状均得到不同程度的缓解,且化痰活血方组和梓醇组哮喘小鼠的哮喘潜伏期明显比模型组延长(P<0.01);2.各组小鼠气道阻力值RI均随着乙酰甲胆碱浓度的增加(0、6.25、12.5、25、50 mg/m L)而增大,模型组气道阻力值RI明显大于正常组,在25mg/m L和50mg/m L时差异最显著,有统计学意义(P<0.01),给予不同剂量的化痰活血方和梓醇干预后,RI值均不同程度的下降(P<0.05或P<0.01);3.哮喘组小鼠气管、肺泡及肺间质周围有大量炎性细胞浸润,基底膜增厚,气道粘膜上皮脱落,粘膜上皮不完整,黏蛋白高分泌和杯状细胞增生,化痰活血方和梓醇干预后上述症状得到不同程度缓解;病理评分结果及阳性面积统计显示,模型组细小气管周围、血管周围、肺间质和总分的评分明显高于正常组,模型组阳性面积明显大于正常组(P<0.01),给予化痰活血方和梓醇干预后,可不同程度的降低细小气管周围、血管周围、肺间质和总分的评分和阳性面积的百分比;4.模型组的白细胞总数明显高于正常组,其中单核细胞数最多;模型组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数及中性粒细胞数明显增加,与正常组相比,差异有统计学意义(P<0.01);化痰活血方和梓醇干预后,BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞数及中性粒细胞数降低(P<0.05或P<0.01);5.模型组小鼠BALF中白介素5(IL-5)、MUC5AC含量明显高于正常组,给予化痰活血方和梓醇干预后,IL-5、MUC5AC在BALF中的含量均不同程度的下降;哮喘模型组小鼠BALF中表介素10(IL-10)和转化生长因子β1(TGF-β1)含量明显低于正常组,给予化痰活血方和梓醇干预后,IL-10和TGF-β1在BALF中的含量均不同程度的上升(P<0.05或P<0.01);6.梓醇(0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、300μM)对刺激剂EGF诱导的16HBE细胞株增殖活性没有影响;7.梓醇(3μM、10μM、30μM)对刺激剂EGF诱导的16HBE细胞株上清液中的MUC5AC有一定抑制作用(P<0.01);结论:1.通过动物整体状况、哮喘潜伏期、HE染色和PAS染色的分析,本实验成功建立哮喘模型;2.化痰活血方和梓醇可以降低哮喘模型小鼠BALF中白细胞总数含量和炎性细胞数量如嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞的含量;3.化痰活血方和梓醇可以降低哮喘模型小鼠气道阻力RI值;4.化痰活血方和梓醇可以缓解哮喘小鼠肺组织中炎性细胞浸润、基底膜增厚、黏蛋白高分泌和杯状细胞增生的症状;5.化痰活血方和梓醇可以降低IL-5、MUC5AC在哮喘小鼠BALF中的含量,升高IL-10和TGF-β1在哮喘小鼠BALF中的含量;6.化痰活血方和梓醇对哮喘小鼠炎症和黏蛋白MUC5AC有一定的抑制作用,其机制可能是通过调控炎症细胞和调节性因子而发挥作用;7.梓醇(0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM、300μM)对16HBE细胞株增殖活性没有影响;8.梓醇(3μM、10μM、30μM)对刺激剂EGF诱导的16HBE细胞株上清液中的MUC5AC有一定抑制作用。
