葛根异黄酮的检测方法与提取纯化工艺研究

葛根是豆科葛属植物野葛或粉葛的块根，含有丰富的异黄酮和淀粉，是国家卫生部批准的药食两用植物。葛根异黄酮具有防治和改善心脑血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、护肝、调节内分泌系统等多种药理作用。葛根总异黄酮含量高达7.6％，有葛根素、大豆苷、大豆苷元等30多种异黄酮成分，其中葛根素是本属特有成分和主要有效成分，约占总异黄酮含量的50％。葛根素的含量与总异黄酮含量常被作为评价葛根质量的主要指标。 我国葛属植物资源丰富，但一直存在着种植与加工规模小、生产工艺与分析检测的技术和设备相对落后、产品附加值不高等突出问题，制约了葛根工业产业化的良性发展。本论文中以此为切入点，研究内容涉及葛根异黄酮的检测方法、提取与分离纯化工艺、体外抗氧化活性等，为开发与综合利用葛根资源和建立葛根产品质量评价指标提供理论依据。主要研究内容如下： （1）葛根异黄酮的检测方法研究。 ①高效液相色谱法（HPLC）定量检测葛根素和大豆苷的含量。确定液相色谱条件为：色谱柱C18（150mm×4.6mm，5μm），DAD检测器，检测波长250nm，参比波长380nm，柱温30℃，进样量5μL，流速0.6mL／min，以乙腈—水为流动相梯度洗脱：0～9min，乙腈—水（10：90）；10～19min，乙腈—水（15：85）；20～30min，乙腈—水（20：80）。在此液相条件下，葛根醇提液中五种组分得到较好地分离。葛根素与大豆苷在一定浓度范围内线性关系良好，最低检测限分别是19.91μg／mL和104.17μg／mL。葛根素加样回收率为99.5％～100.1％，RSD仅0.60％。测得野葛中葛根素和大豆苷是总异黄酮含量的45.35％和4.89％。 ②胶束电动毛细管色谱法（MECC）定量检测葛根素含量。确定毛细管电泳条件为：检测波长250nm，缓冲液为pH值9.0的0.1M KH2PO4溶液—20mM硼砂溶液，SDS浓度40mmol／L，分离电压18kV。在此电泳条件下，葛根醇提液中五种组分得到较好地分离。葛根素在一定浓度范围内线性关系良好，保留时间和最低检测限分别是4.500min和13.74μg／mL，加样回收率是97.2％～100.2％，RSD为4.63％。测得野葛中葛根素是异黄酮的42.25％，与HPLC结果相近。因葛根中大豆苷含量低而MECC最低检测限较高，未能对其作定量检测。 ③紫外光谱法（UV）定量检测总异黄酮含量。葛根素为标样，250nm处检测得野葛总异黄酮含量为6.58％，发现总异黄酮含量与原料品种、生长周期和植物组织部位相关。 ④薄层层析色谱法（TLC）定性分析葛根素和大豆苷。首次采用乙酸乙酯—丙酮—甲苯—水（10：8.5：1.0：1.7，v／v）作展开剂，紫外线（254nm）—碘蒸汽法显色，葛根素和大豆苷在GF254硅胶板上获得较好的分离，R_f值分别是0.43和0.51。 ⑤检测方法的比较。相对于已有的研究报道，HPLC测得葛根素最低检测限更低，检测范围更宽；MECC的准确性与精确度比HPLC略低，但检测葛根素时出峰时间更短，分离度更好，且有毛细管价格低廉、有机溶剂消耗少等显著优点；UV的准确性和精密度不如HPLC和MECC，但操作简便、快速，主要用于后期提取异黄酮中工艺参数的优化；TLC可定性鉴别葛根素、大豆苷等异黄酮，操作简便、快速、专属性强，以判断大孔树脂纯化异黄酮时树脂中异黄酮是否洗脱干净。 （2）葛根异黄酮的提取工艺研究。乙醇回流法提取，进行单因素试验和正交试验，确定最佳提取工艺参数。结果表明，影响异黄酮提取率的各因素主次顺序是：提取温度＞乙醇浓度＞提取时间＞液料比，提取温度的影响高度显著。最佳提取工艺参数为：粒度20目，液料比15，乙醇浓度70％，提取时间1.5h，水浴70℃下回流提取2次。在此条件下，异黄酮提取率达92.83％，纯度为21.65％。 （3）葛根异黄酮的纯化工艺研究。比较S-8、NKA-9、A B-8、X-5、D4006型五种大孔树脂对异黄酮的吸附分离特性，确定选择AB-8大孔树脂。较优纯化条件为：以10.0g干树脂计，0.5mL／min的流速进样，80％的乙醇用量100mL，洗脱流速2.0mL／min。在此条件下，异黄酮纯度从21.65％提高到87.55％，葛根素含量由9.79％提高到92.80％。 （4）葛根异黄酮的体外抗氧化活性研究。结果表明，当葛根异黄酮提取物与BHT的浓度均为0.2730mg／mL时，都能还原产生0.98mmol／g的FeSO4，即总抗氧化能力相当，表明葛根异黄酮具有较强的总抗氧化能力；异黄酮提取物对DPPH·自由基具有较强的清除能力，提取物浓度为0.2275mg／mL和0.2730mg／mL时，清除率分别是65.25％和82.20％，清除能力随着浓度的增加而增强。