左、右归丸及其拆方调节去卵巢骨质疏松大鼠成骨与成脂平衡的研究

目的:基于中医“肾主骨,生髓”理论,探讨滋阴补肾代表方剂左归丸和温肾补阳代表方剂右归丸及其拆方两方所含共同药,左归丸中滋阴药,右归丸中补阳药对去卵巢骨质疏松模型大鼠的防治作用和作用机制,并从阴阳平衡角度探讨成骨分化与成骨过程中骨代谢与脂代谢平衡的相关性。材料与方法:选取90只SPF级2月龄雌性未生育SD大鼠,按体重分层,随机分为正常组10只,假手术组10只,去卵巢模型组70只。去卵巢组采用双侧背部卵巢切除术制备骨质疏松模型,假手术组只去除卵巢周围部分脂肪组织,造模一周后,将术后成活的去卵巢模型组大鼠按体重分层,随机分为模型组和各个治疗组。至此,实验大鼠共分为9组,即正常组(Control),假手术组(Sham),模型组(OVX),补佳乐组(BJL),左归丸组(ZGW),右归丸组(YGW),共同药组(GTY),滋阴药组(ZYY),补阳药组(BYY)。各治疗组灌服对应药物,正常组,假手术组,模型组灌服蒸馏水。经12周给药治疗后取材,除去因手术灌胃等原因死亡,共纳入大鼠76只。取材前禁食不禁水24h,末次给药2 h后称重麻醉,腹主动脉取血,血清离心分装后﹣80℃储存,用于酶联免疫ELISA法检测骨代谢指标血清碱性磷酸酶ALP,骨钙蛋白OC,Ⅰ型前胶原羟基端前肽PICP;取大鼠3、4、5节腰椎,湿纱布包裹置于﹣80℃冻存,用于双能X线骨密度检测;取大鼠股骨远端1/3部分,仔细剥离附着肌肉筋膜及结缔组织,液氮速冻后锡箔纸包裹,﹣80℃冻存,用于实时荧光定量PCR法检测大鼠骨组织RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP、PPARγ、C/EBPβ的基因表达情况和蛋白印记法检测大鼠骨组织RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP、PPARγ、C/EBPβ的蛋白表达情况;取大鼠胫骨近端1/3部分,固定脱钙数周后制成石蜡切片,以备形态学HE检测和RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP、PPARγ、C/EBPβ指标的免疫组化检测。结果:1.左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠骨密度影响与正常组比较,除假手术组外,各组大鼠骨密度都有下调趋势,模型组大鼠腰椎骨密度下降显著,(P<0.01),补佳乐组、左归丸组下调不显著,无统计学意义,显示成功复制PMOP模型;与模型组比较,各治疗组骨密度均有不同程度提高,(P<0.05或P<0.01),其中补佳乐组、左归丸组效果较好,(P<0.01),基本达到假手术组水平,其他组间比较结果无明显差异。2.左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠骨组织形态学影响正常组和假手术组可见骨小梁排列紧密,有规则,形态结构完整、饱满,骨小梁间呈网状连接,骨小梁表面可见较多整齐的、呈单行排列的成骨细胞,骨髓腔相对较小;而模型组骨小梁总量明显减少,结构较为稀疏,连接性差,排列不规则,出现大量骨小梁盲端,小梁壁的厚度不一致,骨小梁表面成骨细胞数目也明显较少,可见大量体积大、形态不规则、多核的破骨细胞,骨髓腔增大;各给药组治疗12周后,骨小梁数目有不同程度增多、骨小梁面积增大,增宽,结构排列形态逐渐与正常组接近,小梁间连接呈网状,骨髓腔缩小,其中补佳乐组,左归丸组,滋阴药组效果明显。3.左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠骨代谢指标的影响与正常组比较,模型组ALP含量显著升高,(P<0.01);与模型组比较,各治疗组ALP含量均有降低,(P<0.05或P<0.01),左归丸组下降显著。与正常组比较,模型组OC含量明显上升,(P<0.05);与模型组比较,补佳乐组、左归丸组、右归丸组、滋阴药组、补阳药组OC含量均有不同程度下调,(P<0.05或P<0.01),左归丸疗效显著,与其他治疗组比较有差异。与正常组比较,模型组PICP含量明显提高,且差异显著(P<0.01);与模型组比较,各治疗组均能使PICP数值下调,且差异显著,(P<0.05或P<0.01),其中左归丸组效果较好。4.左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠成骨分化的影响免疫组化方法检测结果显示:RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP主要表达于成骨细胞浆和细胞核内,正常组骨小梁结构完整,成骨细胞正常表达;模型组可见成骨细胞数量明显的减少,少见棕黄色着色;给药后的各治疗组成骨细胞阳性染色细胞数量显著增加,细胞膜和胞浆见棕黄色颗粒,少量成骨细胞核内也见棕黄色。m RNA检测结果显示:与正常组比较,模型组RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP基因表达均有降低,有显著性差异,(P<0.05);与模型组比较,各治疗组RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP基因表达均有不同程度升高,其中补佳乐组、左归丸组RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP含量升高显著,(P<0.01),达到或高于正常组水平,左归丸优于右归丸,并且优于各拆方组。蛋白表达检测结果显示:与正常组比较,模型组RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP蛋白表达均有降低,有显著性差异,(P<0.05);与模型组比较,各治疗组RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP蛋白表达均有不同程度升高,其中补佳乐组、左归丸组RUNX2、CollagenⅠ、ALP、BGP含量升高显著,(P<0.01)。5.左、右归丸及其拆方对PMOP大鼠成脂分化影响:免疫组化方法检测结果显示:PPARγ、C/EBPβ主要表达于细胞胞浆,正常组、假手术组仅见少量细胞PPARγ、C/EBPβ表达;模型组骨小梁断裂,成骨细胞数量少,可见成骨细胞内以及其他细胞内细胞膜和胞浆明显的棕黄色着色;给药后的各治疗组成骨细胞数量增多,但阳性染色细胞数量减少,少见棕黄色着色。m RNA检测结果显示:与正常组比较,模型组PPARγ、C/EBPβ基因表达均有上调,有显著性差异,(P<0.05);与模型组比较,各治疗组PPARγ、C/EBPβ基因表达均有不同程度下调,其中补佳乐组、左归丸组PPARγ、C/EBPβ含量升高显著,(P<0.01),基本达到正常组水平,左归丸优于右归丸,并且优于各拆方组。蛋白表达检测结果显示:与正常组比较,模型组PPARγ、C/EBPβ蛋白表达上升显著,(P<0.05);与模型组比较,各治疗组PPARγ、C/EBPβ蛋白表达均有不同程度下降,其中补佳乐组、左归丸组PPARγ、C/EBPβ蛋白含量下降显著,(P<0.01)。结论:1.大鼠去除双侧卵巢后,骨量丢失,呈高转换型骨代谢状态,成功复制绝经后骨质疏松模型。2.左、右归丸及其拆方即共同药、滋阴药,补阳药,均能有效防治绝经后骨质疏松症。上述给药组在一定程度上均可促进成骨细胞分化、促进骨形成和骨重建。通过比较研究表明,左归丸优于右归丸、共同药、滋阴药、补阳药。3.大鼠去卵巢骨质疏松症与成骨、成脂失衡有一定的相关性。左、右归丸及其拆方,即共同药,滋阴药,补阳药皆可促进成骨、抑制脂肪细胞分化,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用,其中以左归丸组作用突出。4.寓意“阴阳互济”之意的左、右归丸,均可通过调控成骨与成脂的平衡而有效防治绝经后骨质疏松症;而尤以“阳中求阴”之法立意的左归丸为突出。