茵陈蒿汤保肝作用的药效物质基础研究

茵陈蒿汤源于汉代张仲景所著的《伤寒论》,由茵陈、栀子、大黄组成,具有利胆退黄、抗肝损伤、防治脂肪肝、抗肝纤维化等作用,在肝病治疗领域有着广阔的应用前景。研究茵陈蒿汤保肝作用的药效物质基础,对开发成分清楚、质量可控、疗效稳定的创新中药,从更深层次上挖掘这一经典名方的现代临床应用价值具有重要意义。中药复方所含成分众多,但只有那些吸收进入体内的成分和／或其代谢产物(本课题组将其统称为体内“药源性成分”)才有产生药效的可能,且效应成分必须以血液为介质输送到靶器官或组织才能产生药效。因此,有学者提出了基于“含药血清”的中药复方药效物质基础研究策略,该策略包括“血清药理学”和“血清药化学”研究。所谓“含药血清”是指给动物或人服用药物后采集的血清或血浆；“血清药理学”指采用体外细胞模型对含药血清进行药效评价；“血清药化学”指采用现代分析技术对含药血清中的药源性成分进行定性定量分析。对两者研究结果进行相关性分析可以阐明中药复方的药效物质基础。有鉴于此,本课题在分别建立了茵陈蒿汤血清药理学和血清药化学研究方法的基础上,以大鼠灌胃茵陈蒿汤全方后10个时间点采集的含药血清和7个拆方配伍后固定时间点采集的含药血清为研究对象,一方面测定了这17份含药血清指纹图谱及其中主要药源性成分的含量,另一方面对这17份含药血清进行了保肝活性评价,最后分别采用药时曲线和时效曲线比较及数据处理技术对血清药化学和血清药理学研究结果进行了谱-效和量-效关系分析,初步阐明了茵陈蒿汤保肝作用的药效物质基础。本论文分文献综述和实验研究两大部分。第一部分,文献综述。引用文献213篇,分别对茵陈蒿汤保肝作用的药效物质基础研究现状、血清药理学与血清药化学相结合的中药药效物质研究进展进行了文献综述,在此基础上简要介绍了本课题的研究思路和方案设计。第二部分,实验研究。包括以下3个方面：一、茵陈蒿汤血清药理学1、茵陈蒿汤含药血清制备方法研究建立了CCl4诱导的原代培养大鼠肝细胞损伤模型,以SD大鼠为含药血清供体,以含药血清对损伤肝细胞增殖的影响为指标,采用正交试验法优选了含药血清的制备方法。结果表明,每天以成人等效剂量的10倍茵陈蒿汤提取物间隔8h分两次给正常大鼠灌胃给药,连续3天,末次给药后1h采集血浆比较合理,该条件下制备的茵陈蒿汤含药血清对肝细胞损伤具有明显保护作用。2、H2O2诱导的HL-7702肝细胞损伤模型的建立考察了造模时间及H202添加浓度对细胞增殖和AST泄漏的影响,建立了H202诱导的HL-7702肝细胞损伤模型。结果表明,H202与正常肝细胞作用4h为适宜的造模时间,0.5mmol/L和2.5mmol/L H2O2分别为细胞增殖试验和AST泄漏检测的适宜造模浓度。3、体系中含药血清添加量考察分别将去蛋白处理的含药血清以5%、10%、20%和40%的浓度加入培养体系,分别以细胞增殖和AST泄漏为指标,考察了体系中含药血清适宜的添加量。结果表明,体系中添加5%的含药血清能明显促进损伤肝细胞增殖,减少AST泄漏。二、茵陈蒿汤血清药化学研究1、含药血清HPLC-UV指纹图谱研究采用HPLC法测定了10批含药血清指纹图谱,建立了238nm和440nm下茵陈蒿汤含药血清指纹图谱共有模式,并与空白血清、体外指纹图谱和对照品指纹图谱色谱峰的保留时间、紫外吸收光谱图比对,对含药血清中的药源性成分进行了分析。结果表明,两个波长下10批含药血清指纹图谱相似度良好。238nm下含药血清指纹图谱产生了9个药源性成分；440nm下产生了15个药源性成分,其中4个为238nm下的共有成分。所有20个药源性成分中,6个为体外原形成分,14个为体内代谢产物。原形成分中3个分别被指认为来源于栀子的环烯醚萜类成分京尼平苷酸和栀子苷以及来源于大黄的蒽醌类成分大黄酸,另外3个原形成分中的1个为来源于大黄的蒽醌类成分,2个为来源于栀子的西红花酸类成分。14个体内代谢产物中的1个为环烯醚萜类成分的代谢产物、4个为蒽醌类成分的代谢产物、9个为西红花酸类成分的代谢产物。2、茵陈蒿汤含药血清中京尼平苷酸、栀子苷、大黄酸含量测定建立了HPLC法测定茵陈蒿汤含药血清中京尼平苷酸、栀子苷和大黄酸3个药源性成分含量的方法。结果表明,京尼平苷酸、栀子苷、大黄酸分别在0.0019～0.571μg(r-0.9998)、0.0018～０．54μg(r-=0.9999)、0.0016-0.48μg(r=0.9999)范围内与峰面积呈良好线性关系。所建立的方法简便、准确、专属性强,可用于茵陈蒿汤含药血清中3个成分的含量测定。三、茵陈蒿汤保肝作用药效物质基础的谱-效、量-效关系分析1、不同时间点含药血清保肝作用的谱-效、量.效关系分析采集了大鼠灌胃茵陈蒿汤全方后10个时间点含药血清,采用己建立的方法测定了含药血清指纹图谱和含药血清中京尼平苷酸、栀子苷、大黄酸3个成分的含量,并进行了保肝活性评价,分别采用药时曲线和时效曲线比较及数据处理技术进行了含药血清经时谱-效和量-效关系分析。结果表明,茵陈蒿汤含药血清中与肝细胞损伤保护作用相关的成分包括来源于大黄的原形蒽醌类成分及其体内代谢产物、来源于栀子的原形环烯醚萜类成分及其体内代谢产物、来源于栀子的原形西红花酸类成分及其体内代谢产物,其中2个蒽醌类成分代谢产物、1个原形蒽醌类成分、1个西红花酸类成分体内代谢产物活性较强。研究结果同时提示,含药血清所含蒽醌类成分大黄酸及环烯醚萜类成分栀子苷、京尼平苷酸等可能具有肝细胞保护和损伤双向作用,即低剂量保护高剂量则产生毒性。2、拆方配方含药血清保肝作用的谱.效、量-效关系分析采集了大鼠灌胃茵陈蒿汤7个拆方配伍后1h含药血清,采用与全方不同时间点含药血清相同的方法进行了指纹图谱和含量测定及保肝活性评价,并运用数据处理技术进行了谱-效和量-效关系分析。结果表明,茵陈蒿汤含药血清中与肝细胞损伤保护作用相关的成分包括来源于大黄的原形蒽醌类成分及其体内代谢产物、来源于栀子的原形环烯醚萜类成分及其体内代谢产物、来源于栀子的原形西红花酸类成分的体内代谢产物,其中1个蒽醌类成分代谢产物活性较强。综合以上含药血清谱-效、量-效关系研究结果,得出结论如下：茵陈蒿汤保肝作用的药效物质基础包括来源于大黄的原形蒽醌类成分及其体内代谢产物、来源于栀子的原形环烯醚萜类成分及其体内代谢产物、来源于栀子的原形西红花酸类成分的体内代谢产物,其中1个蒽醌类成分体内代谢产物活性较强。