橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1木聚糖酶基因xynB在毕赤酵母中的高效表达

木聚糖酶是可将木聚糖降解为低聚糖和木糖的一类酶的总称。它广泛地存在于各种微生物中，在饲料、造纸、食品医药以及能源工业中有着广阔的应用前景。我们将来源于橄榄绿链霉菌A1(Streptomyces olivaceoviridis A1)的木聚糖酶基因xynB的成熟蛋白编码序列克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9α中，转化Pichia pastoris GS115得到重组子，实现了木聚糖酶基因xynB的高效表达，表达产物能有效分泌且具有正常的生物学活性。在3升发酵罐中木聚糖酶的表达量达1200IU／mL。SDS-PAGE分析表明，毕赤酵母表达产物XYNBa的分子量为31kD，大于橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB的23kD。进一步对XYNBa进行了脱糖基化处理得到XYNBb,其分子量恢复到23kD，证明XYNBa是糖基化蛋白。通过对毕赤酵母重组表达的木聚糖酶XYNBa、脱糖基化的木聚糖酶XYNBb以及橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB之间酶学性质的比较发现：三种酶的最适pH差异不大，XYNB和XYNBa均为5.2，XYNBb为5.0；XYNB和XYNBa的最适温度均为60℃，XYNBb降为50℃：在耐热性上，XYNBa由于糖基化作用热稳定性明显高于未糖基化的XYNB和XYNBb；XYNBa和XYNBb的比活性分别为883.88IU／mg和832.51IU／mg，明显低于原酶的比活2814.45IU／mg；XYNB和XYNBa的Km值相当，分别为21.56(g／Kg)和20.87(g／Kg)，而XYNBb的Km值较大为27.10(g／Kg)；XYNBa和XYNBb的Vmax相差不大，分别为4568μmol／mg·min和5329μmol／mg·min，明显低于XYNB的27623μmol／mg·min此外三种酶均无纤维素酶活性，对胃蛋白酶和胰蛋白酶有很好的抗性，且对作用环境中的各种离子、表面活性剂、螯合剂不敏感。通过对不同木聚糖的酶解产物的糖份分析发现：以桦木木聚糖为底物时，酶解产物主要为木三糖和木四糖，含量分别为68.43％和16.50％，另外还含有11.79％的木二糖；以玉米芯木聚糖为底物时，酶解产物主要为木二糖和木三糖，含量分别为81.78％和11.55％。证实该酶为内切β—1—4木聚糖酶，非常适用于低聚木糖的工业化生产。