灰树花深层发酵条件优化及其菌丝体抗肿瘤糖肽的研究

灰树花[ Grifola frondosa （Dicks. Fr.） S. F. Gray ]是近年来开发比较多的珍奇药食用菌之一,其多糖和多糖复合物在抗肿瘤、抗病毒、增强免疫、降血糖、治疗糖尿病等多方面的具有明显的生物活性。本论文在实验室前期研究工作的基础上,对灰树花菌丝体的深层发酵培养基优化、扩大培养、菌丝体中抑瘤活性物质的分离和筛选、组成结构、抑瘤活性物质的体内外抑癌活性及机理等方面进行了较为深入的研究。根据实验室前期工作所得到的结论,利用Box-Behnken 3×3设计优化了影响灰树花深层发酵菌丝体和胞外聚合物的生产的主要培养基组成碳源（葡萄糖）、氮源（蛋白胨）和无机盐（KH2PO4）。响应面分析结果表明,各因素及其交互作用对响应值（灰树花菌丝体和胞外聚合物产量）均存在显著的相关性。通过典型性分析,获得最大菌丝体（17.61 g/l）时培养基组成为:葡萄糖45.2 g/L,KH2PO4 2.97 g/L,蛋白胨6.58 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L和玉米浆15 g/L;而获得最大胞外聚合物量（1.326 g/L）时的培养基组成为:葡萄糖58.6 g/L,KH2PO4 4.06 g/L,蛋白胨3.79 g/L,MgSO4·7H2O 1 g/L和玉米浆15 g/L。与其他实验组的结果相比,优化后的灰树花菌丝体与胞外聚合物的量都有较大的增加。15 L发酵罐扩大培养的结果表明,在优化培养基组成的条件下,扩大培养后的菌丝体产量最大值达22.50 g/L。 采用15 L搅拌式发酵罐研究灰树花的扩大培养条件,主要考察了搅拌转速和通气量对灰树花菌丝量、胞外聚合物产率、溶氧、菌丝形态以及发酵液粘度的影响。研究结果表明搅拌转速和通气量能显著影响灰树花的生长,并且通过对灰树花菌丝球的大小、形态以及胞外聚合物的分泌影响发酵液的粘度。并得出较为优化的培养条件为:温度25℃,通气量0.75 vvm,搅拌转速100 r/min,装液量60%;在此条件下,发酵10天后,灰树花菌丝体最大得率为23.95 g/L,胞外聚合物的得率为1.421 g/L。 以体外抑制肿瘤细胞增殖的活性作为筛选导向,采用DEAE-Sepharose Fast Flow柱、Sephadex G-100柱和AKTA快速分离制备系统对灰树花发酵菌丝体的粗提物进行分离纯化,从灰树花深层发酵培养菌丝体中提取、分离纯化得到一种活性酸性糖肽GFPS1b。HPGPC法测得其重均分子量为21 kDa。样品中蛋白含量16.70%,糖含量为86.0%,并含有4.3%的糖醛酸。利用化学方法（单糖组成分析、部分酸水解、甲基化分析）和光谱方法（GC、GC-MS、红外吸收光谱、核磁共振）分析GFPS1b的糖链结构,结果表明其单糖组成主要有Glc、Gal、Ara,其糖链主链由两个α–D-Glc （1→3）、α–D-Gal （1→4）、α–D-Glc （1→3,6）和α–D-Gal（1→6）组成的,其中葡萄糖基的6位发生取代,取代侧链主要为α-L-Ara -（1→4）-α–D-Glc (1→。该结构与从灰树花子实体中所提取的多糖D-Fraction以及杜巍等所纯化的组分G.F.-2的结构都有很大的不同,因此可以认定GFPS1b为一新的糖肽。 通过建立小鼠移植黑色素瘤B16模型,研究了GFPS1b的体内抗肿瘤作用。对荷瘤