牛黄参含药血清诱导人肝癌细胞HepG2凋亡及其分子机制研究

【目的】在细胞和分子水平探讨牛黄参含药血清(NHS)诱导人肝癌细胞HepG2凋亡及其可能的作用机制,为其在肝癌中的广泛应用提供实验基础和理论支持。【方法】结合细胞与血清药理学实验方法,对比空白血清、阳性药CTX、不同浓度组NHS含药血清对HepG2细胞凋亡及凋亡相关调控基因Cyclin D1、FAS及线粒体膜电位的影响。主要实验过程如下:1.制备空白对照、CTX及NHS含药鼠血清,并体外培养人肝癌细胞HepG2。2.用CCK-8法检查CTX及0%、5%、10%和20%NHS含药血清对HepG2细胞生长抑制率。3.HepG2细胞给药48 h后,DAPI染色,荧光显微镜下观察细胞形态学变化。4.HepG2细胞给药48 h后,凝胶电泳检测DNA ladder。5.实时定量PCR检测NHS含药血清对HepG2细胞细胞周期蛋白Cyclin D1 mRNA表达的影响。6.免疫组织化学和流式细胞术检测NHS含药血清对HepG2细FAS抗原表达的影响。7.流式细胞术检测NHS含药血清对HepG2细胞线粒体膜电位的影响。【结果】1.成功制备NHS含药血清,随着NHS浓度的增加,HepG2细胞的生长明显受抑,20%NHS组其细胞抑制率和CTX组相当,差别无统计学差异;随着药物作用时间的延长,细胞生长受抑程度明显加重。2.采用荧光显微镜检测DAPI染色的两组细胞可以发现,与空白对照组相比,20%NHS孵育48小时后,HepG2细胞核染色质明显固缩和碎裂,产生凋亡小体。3.DNA Ladder检测提示HepG2细胞加入CTX和不同浓度的NHS后,与空白组相比均有连续的寡克隆带或多聚体的形成,浓度5%、10%和20%的NHS含药血清均具有和CTX基本一致的寡克隆带形成,表明其具有明显的促进细胞凋亡的作用。4.随着NHS浓度的逐步增加(5%NHS组、10%NHS组和20%NHS组),Cyclin D1 mRNA的表达水平逐渐下降,而且20%NHS组的表达量与空白对照组相比,差别具有明显的统计学意义(P<0.05)。5.免疫组化结果显示,与空白对照组相比,除CTX组的细胞内棕黄色颗粒明显增多外,从5%到20%的NHS含药血清组,阳性细胞的比例明显增高,提示Fas的表达逐渐增强。与空白对照HepG2的Fas阳性细胞数(1.75±0.34)%相比,不同浓度的NHS含药血清(5%,10%,20%)孵育48小时后的Fas阳性细胞数分别为(6.54±0.98)%,(13.84±0.72)%和(27.03±2.01)%,与空白对照相比均有统计学意义(P<0.01),提示Fas蛋白表达升高具有明显的浓度依赖性,且20%NHS含药血清组与CTX组相比差别没有统计学意义。6.NHS作用于HepG2细胞后48 h,,荧光强度随着NHS浓度升高而逐渐降低,提示线粒体膜电位水平降低。【结论】NHS含药血清具有诱导HepG2细胞凋亡的作用,其诱导凋亡的机制可能是通过下调细胞周期蛋白Cyclin D1表达,升高FAS表达水平及降低线粒体膜电位相关。