目的
1.评价补肾调周法干预行夫精人工授精(IUI)患者的临床疗效,观察补肾调周法对卵泡发育及子宫内膜容受性的影响,探讨其提高临床妊娠率的机理。
2.研究育泡饮(补肾调周系列方组成之一)对体外培养大鼠卵巢颗粒细胞增殖、分泌、细胞周期的影响以及其对EGFR、CX43、P38MAPK蛋白表达的影响,从细胞及分子生物学水平探讨育泡饮促卵泡发育的作用机制,为验证育泡饮的有效性提供科学、客观的实验依据。
方法
临床研究
1.将符合本研究入选标准的60例患者,随机分成两组,统一选用氯米芬促排卵方案,对照组(氯米芬组)34例,治疗组(补肾调周系列方联合氯米芬组)26例。观察两组患者治疗前后中医肾气虚证候变化；治疗后肾气虚证候积分与HCG注射日子宫内膜厚度、内膜血流参数以及卵泡周围血流、子宫动脉血流参数的相关性。
2.比较两组患者HCG注射日子宫内膜厚度、类型,卵泡周围血流、子宫动脉血流、子宫内膜血流参数以及临床妊娠率。
实验研究
1.制备育泡饮水提醇沉液,过滤后4℃冰箱保存备用。
2.育泡饮水提醇沉液作用于卵巢颗粒细胞药物浓度的确定：将1×10-7g/ml～1×10-3g/ml浓度的育泡饮水提醇沉液分别作用于体外培养大鼠卵巢颗粒细胞,培养24、48、72h,设立空白对照组。通过MTT法检测该药物对颗粒细胞增殖的影响,确定药物作用的量效时点以进行后期试验。
3.育泡饮水提醇沉液对颗粒细胞分泌功能、细胞周期以及EGFR、CX43、P38MAPK蛋白表达的影响：颗粒细胞预培养48h后,随机分组,加入促卵泡激素FSH(50ng／m1)和不同剂量的育泡饮,并设立空白对照组,继续培养48h后,化学发光法检测颗粒细胞培养液中E2的分泌量,流式细胞术检测颗粒细胞周期的分布,Western-Blot法检测EGFR、CX43、P38MAPK的表达。
结果
1.临床观察表明,经补肾调周系列方治疗后,治疗组患者肾气虚症状改善情况优于对照组,组间比较有统计学意义(P<0.05)。两组患者中医证候疗效比较结果显示：治疗组显愈率为23.08%,总有效率为69.23%,对照组分别为11.76%和41.18%,治疗组显示出明显的疗效优势(P<0.05)；两组患者治疗后肾气虚证候积分与子宫内膜厚度、卵泡血流参数、子宫动脉及子宫内膜血流参数均存在相关性。其中与子宫内膜厚度呈负相关；与内膜血流PI、RI,子宫动脉血流RI及卵泡血流RI均成密切正相关。
2.治疗组患者在IUI周期HCG注射日子宫内膜厚度明显增加,而卵泡周围血流PI、RI,子宫动脉PI、RI,子宫内膜血流PI、RI均明显降低,与对照组比较均具有显著性差异(P<0.05)；HCG注射日治疗组A型内膜占53.85%,B型占38.46%,而对照组分别为23.53%和29.41%,两组相比较,差异显著(P<0.05)；两组妊娠率比较结果显示,治疗组临床妊娠率为34.61%(9/26),周期妊娠率19.56%(9/46),对照组分别为11.76%(4/34)和6.06%(4/66),两组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。
3.育泡饮水提醇沉液在1×106g/ml～1×10-4g/ml药物浓度范围内,随着药物浓度的增加,培养时间的延长,其促进颗粒细胞增殖的能力逐渐增强,在培养48h时作用最佳。
4.育泡饮水提醇沉液低、中、高剂量组均能促进颗粒细胞E2分泌,与空白组相比较有显著性差异(P<0.05),随着育泡饮药物浓度的增大,E2的分泌逐渐增加。与FSH组相比较,育泡饮低剂量组与其有显著性差异(P<0.05),而育泡饮中、高剂量组与FSH组促进E2分泌的作用无明显差异。
5.经流式细胞仪检测,结果显示空白对照组颗粒细胞G0/G1期比例较育泡饮水提醇沉液低、中、高剂量组及FSH组明显增高,而S期比例及PI值则明显降低(P<0.05)。高剂量组与FSH组比较,G0/G1期细胞明显减少,S期细胞及PI值则明显增加(P<0.05)。而低剂量、中剂量组与FSH组比较,无差异(P>0.05)。
6.育泡饮水提醇沉液呈剂量依赖性促进颗粒细胞EGFR表达。在低剂量作用下颗粒细胞EGFR表达开始增强,与空白对照组比较具有明显差异(P<0.05),高剂量组的促进作用最为显著(P<0.05)。与FSH组比较,低剂量组促颗粒细胞EGFR表达的能力明显降低(P<0.05)。而高剂量组与FSH的作用相比较无统计学差异(P>0.05)。
7.与空白组相比较,育泡饮水提醇沉液低、中、高剂量组及FSH组CX43蛋白表达均显著升高(P<0.05),不同浓度的育泡饮水提醇沉液与FSH组比较,中、低剂量组CX43蛋白表达较之明显降低(P<0.05)。高剂量组CX43蛋白的表达与之无显著性差异(P>0.05)。提示随着育泡饮水提醇沉液浓度的增加,颗粒细胞CX43蛋白表达也随之增强,高浓度的育泡饮可以达到与FSH相同的效果。
8.与空白组相比较,育泡饮水提醇沉液各剂量组及FSH组均能促进P38MAPK表达增加(P<0.05)。与FSH组比较,除低剂量组育泡饮P38MAPK表达明显降低(P<0.05),中、高剂量组P38MAPK表达与之无显著性差异(P>0.05)
结论
1.补肾调周法配合氯米芬,可明显提高IUI患者临床妊娠率。其机制可能与补肾调周系列方药改善卵泡周围血流,促进卵泡发育成熟；增加子宫内膜厚度、改变子宫内膜形态,降低子宫内膜及子宫动脉血流阻力,增加子宫动脉及子宫内膜血流灌注,增强子宫内膜容受性有关。
2.颗粒细胞的增殖对于卵泡发育是必须的,育泡饮不仅能促进颗粒细胞的分泌,还能推动细胞周期进程,促进颗粒细胞增殖；上调CX43蛋白的表达,增强颗粒细胞的抗凋亡能力；调节EGFR的表达量,激活P38MAPK通路,促进卵母细胞成熟,通过以上多种途径共同作用,从而促进卵泡的发育与成熟。
