川陈皮素诱导肠动力平衡和缓解炎性肠病研究

研究背景：炎性肠病是一种慢性的反复发作的肠道炎症性疾病；临床症状包括腹痛、腹泻、便血,其中结肠炎患者有罹患结肠癌的危险,目前在医学上尚无治愈炎性肠病的疗法或是药物。炎性肠病与肠道过度的炎性反应、肠上皮过高的通透性以及失衡的胃肠动力平衡密切相关。已知川陈皮素对肺炎和皮肤性炎症有很好的缓解作用及具有抗癌和缓解消化不良等功效,但其对肠动力失衡及肠道炎症的作用未见相关研究。实验目的：1、考察川陈皮素对处于不同收缩状态的大鼠空肠平滑肌收缩性的作用,揭示川陈皮素可以诱导肠动力平衡；2、考察评价川陈皮素对三硝基苯磺酸所致大鼠结肠炎的缓解作用；实验方法：1、川陈皮素诱导肠动力平衡研究：(1)通过建立动物模型改变、向克氏液中加入激动剂／阻断剂以及改变克氏液中离子浓度等三种方式建立六种不同高低收缩状态,在离体条件下考察川陈皮素对处于不同高低收缩状态的大鼠离体空肠平滑肌收缩性的作用；(2)在体条件下考察川陈皮素对便秘型大鼠以及腹泻型大鼠排便的作用(粪便数目和含水量)。采用蛋白印迹、实时定量PCR (RT-PCR)等方法考察大鼠小肠组织中肌球蛋白轻链磷酸化水平以及肌球蛋白轻链激酶的mRNA水平和蛋白含量；(3)分别考察钙离子、胆碱能神经、胆碱能M受体、肾上腺素能神经、α肾上腺能受体、p肾上腺能受体、可释放一氧化氮的神经元等是否参与川陈皮素诱导的肠动力平衡；2、川陈皮素缓解炎性肠病研究：(1)采用结肠单次灌注三硝基苯磺酸的乙醇溶液(120 mg/kg)建立炎性肠病的大鼠模型,考察川陈皮素对炎性肠病的缓解作用。(2)通过观察大鼠体重、摄食量、组织形态学变化、肠道上皮间通透性等考察川陈皮素对炎性肠病的缓解作用。(3)采用ELISA方法研究大鼠结肠组织中肿瘤坏死因子a、白细胞介素1β、白细胞介素6、一氧化氮和前列腺素-2的变化；采用蛋白印迹方法考察结肠组织中claudin-2、肌球蛋白轻链激酶、核转录因子kappaB-p65亚基、信号通路蛋白PI3K/Akt、诱导性一氧化氮合酶、环氧合酶2的蛋白含量变化,采用RT-PCR方法检测肌球蛋白轻链激酶的mRNA含量变化,结合细胞转染技术等揭示川陈皮素缓解炎性肠病的机制。实验结果：1、川陈皮素诱导胃肠动力平衡研究：(1)在较低剂量(1.25-5.0 μmol/L)时,川陈皮素对小肠平滑肌收缩性产生兴奋作用,在较高剂量(10.0-40.0 μmol/L)时,川陈皮素对小肠平滑肌收缩性产生舒张作用。在2.5 μmol/L浓度时,川陈皮素可以兴奋低收缩状态下小肠平滑肌,而会舒张高收缩状态下小肠平滑肌,也就是说可以对小肠平滑肌收缩性产生双向调节作用,。(2)川陈皮素诱导的双向调节作用可分别被维拉帕米、河豚毒素、阿托品、酚妥拉明、普萘洛尔或者左旋硝基精氨酸所阻断,提示川陈皮素诱导的双向调节作用是钙依赖性的,是通过钙依赖的肌球蛋白磷酸化实现的。所起的兴奋作用通过兴奋胆碱能神经、进而促进内源性乙酰胆碱的摄取、激活胆碱能M受体实现的,所起的抑制作用是通过兴奋肾上腺素能神经、进而激活α肾上腺能受体、β肾上腺能受体、兴奋包含一氧化氮神经元、促进一氧化氮的合成、促进一氧化氮舒张肠道平滑肌实现的。(3)在体研究中,川陈皮素可以显著改善便秘型以及腹泻型大鼠的排便习惯(粪便数目和含水量),显著提高了便秘模型大鼠小肠组织中肌球蛋白磷酸化以及肌球蛋白轻链激酶的,mRNA水平和蛋白含量表达,而显著抑制了腹泻模型大鼠小肠组织中肌球蛋白磷酸化以及肌球蛋白轻链激酶的mRNA水平和蛋白含量表达。2、川陈皮素缓解炎性肠病研究：(1)川陈皮素可显著降低炎性肠病模型大鼠的体重和摄食量；显著缓解中性粒细胞浸润以及肠道上皮过高的通透性；降低结肠粘膜损伤评分、结肠指数和髓过氧化物酶活性;(2)川陈皮素显著降低了炎性肠病模型大鼠结肠组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1p、白细胞介素6、一氧化氮和前列腺素-2以及核转录因子kappaB p65亚基的表达;川陈皮素显著降低诱导型一氧化氮合酶以及环氧合酶-2的表达；川陈皮素显著降低炎性肠病大鼠的肠通透性,降低结肠组织中claudin-2、肌球蛋白轻链激酶、PI3K、Akt的表达。细胞转染的结果提示我们Akt通路和NF-κB通路参与了川陈皮素对受损屏障功能的保护作用。实验讨论：1、研究提示,川陈皮素通过对肠神经系统的调节,对肠动力起到双向调节作用,尤其是对于离体小肠平滑肌收缩性产生了双向调节作用；在体研究中,川陈皮素对于便秘以及腹泻模型大鼠中异常表达的肌球蛋白轻链激酶也可产生作用以至恢复正常表达。2、川陈皮素可以显著缓解模型大鼠的结肠炎症,其作用机制与降低促炎因子、炎性介质以及相关蛋白表达相关；3、川陈皮素可以显著恢复受损的大鼠肠道上皮间通透性,其作用机制与抑制Akt-NF-κB-MLCK通路,保护粘膜屏障有关。创新点：1、本实验首次揭示川陈皮素对大鼠空肠平滑肌的收缩性的双向调节作用,该双向调节作用是由平滑肌收缩状态决定的,是钙依赖性的,是由肠神经系统介导实现的；2、本研究首次揭示川陈皮素对三硝基苯磺酸所致大鼠结肠炎的缓解作用,其治疗作用与抗炎、恢复受损的粘膜屏障和增加肠动力密切相关；本研究首次提出多靶点治疗,即通过抗炎、保护粘膜屏障和诱导肠动力平衡来治疗结肠炎。意义：1、川陈皮素对对高收缩状态的平滑肌有舒张作用,对低收缩状态的平滑肌有兴奋作用也就是说对空肠平滑肌收缩性起到了双向调节作用。这提示我们川陈皮素可以拮抗处于异常收缩状态下的平滑肌,使之恢复平衡。2、川陈皮素可以显著缓解三硝基苯磺酸所致的结肠炎,为临床炎性肠病治疗提供一定科学信息。