β-葡萄糖苷酶生产菌的选育及其对葡萄酒中结合态香气的影响

β-葡萄糖苷酶是风味修饰中的关键酶,对葡萄酒香气的提升具有十分重要的作用,可用于饮料及食品工业中。国内的β-葡萄糖苷酶全都依赖于国外酶制剂公司,其价格昂贵,不适于工业化生产,国内还尚未出现适合的产品,而国内对于酶解葡萄结合态香气成分的研究也尚属空白。因此,需要研究具有自主知识产权并对葡萄酒香气物质起着重要作用的β-葡萄糖苷酶。从自然界中直接筛选在葡萄酒酿造环境中仍有高效酶活力的p-葡萄糖苷酶的菌株,成为得到高产β-葡萄糖苷酶菌株的最直接的方法。它可以改善葡萄酒的风味,又能节省购买酶的成本。 1.本论文创新运用了一种快速、高效的筛选β-葡萄糖苷酶产生菌的方法—以p-NPG为底物的96孔板显色法,利用这种方法,从葡萄园的土壤及葡萄表皮中筛选得到了若干株具有β-葡萄糖苷酶活力的菌株。通过酶活比较得出其中三株菌酶活较高,将该三株菌加入到葡萄结合态香气中反应,其中一株效果最好且酶活最高,本论文对该菌株进行了研究。通过形态观察和18S rDNA序列分析,将该菌株鉴定为Aspergillus niger(黑曲霉)。 2.本论文首先通过测定酶活力的高低,自行筛选出了三株产β-葡萄糖苷酶的菌株并将其应用于玫瑰香葡萄的结合态,结合固相微萃取、气质联用等技术,经β-葡萄糖苷酶作用发生水解断裂产生典型的萜烯、醇类、酯类等化合物,释放出令人愉快的香气物质。其中黑曲霉作用产生的香气物质含量远高于其他两种菌株,其中萜烯类香气物质最为丰富,占总香气含量的85.91%。说明β-葡萄糖苷酶对于增加葡萄结合态香气物质具有显著的作用。此类萜烯类化合物可以赋予葡萄酒特有的果香,而该差异性为实现葡萄酒香气的定向修饰特征提供了依据。 3.为了更好的工业化生产,本论文利用合肥中科院的离子注入机对该菌株进行离子束诱变实验以提高其酶活。并对发酵培养基和发酵条件进行了优化,得到了最佳培养基培养条件,即麸皮4%,(NH4)2SO40.2%,尿素0.2%,KH2P04 O.1%,MgS04·7H2O0.04%,CaCl20.04%,接种量4%。最佳培养条件为：装液量为20 mL(250 mL瓶)；培养温度为30℃；摇床转速为180 r/min。经离子束诱变改造以及培养基条件的优化后该菌株产酶能力得到了较大的提高,比优化前提高了2.26倍,在发酵第7d时达到27.63 IU/mL。这与现在研究报道出的细菌、酵母以及其它菌株的β-葡萄糖苷酶酶活相比都有明显的优势。 4.为了更好的考察该酶是否适用于葡萄酒酿造,论文通过硫酸铵盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析对该菌株所产生的β-葡萄糖苷酶进行分离纯化并对其酶学性质进行了研究,该酶分子量为116 kDa左右,最适温度为50℃,最适pH值为5.0,对酒精有一定的耐受性,其中Cu2+对该酶有明显的抑制作用。