半枝莲多糖的提纯、结构解析及其抗氧化活性的研究

半枝莲为唇形科植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草,分布在我国大部分地区。半枝莲作为传统的中药具有抗肿瘤、抑菌、解热等活性,其主要化学成分为黄酮类化合物、生物碱、挥发油及多糖等,多糖是半枝莲中的主要化学成分之一,有多种生物活性,但目前对半枝莲多糖的分离纯化及结构性质的研究报道甚少。本文研究了半枝莲多糖的提取、分离、纯化及硫酸化修饰,并且对半枝莲多糖SBP、SBP1、SBP2、SBPⅠ、SBP-L、SBP-L1和SBP-L2的体外抗氧化活性及其化学结构进行了研究,为今后半枝莲多糖更深入的研究与开发奠定了基础。研究结果如下: 1.在单因素实验基础上,设计正交实验优化了半枝莲粗多糖的提取工艺,得到热水提取半枝莲粗多糖的最佳工艺参数为:提取温度60℃,料液比1:20,提取时间2h,提取次数4次,半枝莲粗多糖的提取率为2.82%,并采用苯酚.硫酸法对多糖含量进行了测定。 2.进行了多糖脱色工艺的研究,对活性炭、中性氧化铝、大孔吸附树脂AB-8、LSA-21和NKA-9五种脱色剂的脱色性能进行了比较,从中筛选出了最佳的脱色剂为大孔吸附树脂AB-8。通过单因素实验确定了脱色的最佳条件是pH为7,温度为40℃,溶液中多糖含量为1046.5 mg/L。采用最佳条件脱色验证,测定多糖的保留率为88.46%,脱色率为90.65%。 3.脱色后的多糖（SBP）采用季铵盐沉淀法（Hexadecyltrimethylammoniumbromide,CTAB）进行分离,得到半枝莲多糖亚组分SBP1和SBP2。采用DE-52纤维素离子交换柱层析对多糖SBP进行了分级分离,得到水洗组分SBPⅠ用0.1 moL/LNaCl溶液洗脱得到SBPⅡ。利用Sephdex-200柱层析、高效液相色谱、紫外光谱和冻融法对SBPⅠ进行纯度鉴定,证明了SBPⅠ为组成均一的多糖组分。 4.对多糖进行了硫酸化修饰。采用氯磺酸-吡啶法对半枝莲多糖SBP进行硫酸酯化修饰,得到多糖SBP-L,其水溶性较原多糖明显提高,通过紫外分光光度计扫描在262 nm处有吸收峰,测得的SO42-浓度为5.73 mg/mL,取代度为0.35。红外光谱显示在1258 cm-1附近出现硫酸基(-O-SO3-)的特征吸收峰。 5.采用气相色谱法对半枝莲多糖的单糖组分进行了分析。比较了硅烷衍生化、糖腈衍生化法和糖醇衍生化三种衍生化方法,确定了糖腈乙酰化法为最佳的衍生化方法;通过单因素实验确定了硫酸水解半枝莲多糖的最佳条件为:硫酸浓度为0.5 mol/L、体积2 mL、水解时间12 h、温度100℃:气相色谱测定半枝莲多糖SBP由鼠李糖阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比为3.26:0.37:4.85:5.16:4.10:9.47,SBP-L由阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比为0.84:6.67:3.62:5.53,SBP1,SBP2,SBP-L1,SBP-L2和SBPⅠ都由鼠李糖木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比依次为4.51:5.50:4.86:4.90:8.22,3.25:6.20:5.85:4.05:11.30,3.86:4.39:4.96:4.95:7.73,3.04:6.87:5.51:4.37:10.90,3.53:4.62:7.22:4.08:8.37。 6.利用高效液相色谱测定多糖的分子量,得到半枝莲多糖SBP1、SBP2、SBPⅠ、SBP-L1和SBP-L2的分子量依次为:290000Da、340000Da、300000Da、360000Da和390000Da;采用部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解结合气相色谱和红外光谱对半枝莲多糖进行结构分析,确定了多糖的结构:SBP1和SBP2糖链连接方式都是由β-（1→2）—吡喃葡聚糖及半乳糖构成主链,其中SBP1由（1→3,4,6）—鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖残基组成侧链分支,多糖中（1→6）键、（1→3）键、（1→2或1→4）键摩尔百分比约为9%:22%:69%,SBP2由（1→3,4,6）—鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖残基组成侧链分支,多糖中（1→6）键、（1→3）键、（1→2或1→4）键摩尔百分比约为12%:26%:62%:SBPⅠ以β—（1→2,3）—吡喃葡聚糖及半乳糖构成主链,由（1→4,6）—鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖残基组成侧链分支,多糖中（1→6）键、（1→3）键、（1→2或1→4）键摩尔百分比约为10.6%:47%:42.4%:SBP-L1以β—（1→2）—吡喃葡聚糖及半乳糖构成主链,由（1→3,4,6）—鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖和葡萄糖残基组成侧链分支,并存在少量α—糖苷键型吡喃糖基,多糖中（1→6）键、（1→3）键、（1→2或1→4）键摩尔百分比约为9.6%:38.6%:51.8%;SBP-L2以β—（1→2）—吡喃葡聚糖及半乳糖、阿拉伯糖构成主链,由（1→3,4,6）—鼠李糖、甘露糖和葡萄糖残基组成侧链分支,多糖中（1→6）键、（1→3）键、（1→2或1→4）键摩尔百分比约为10.6%:24.2%:65.2%。 7.对七种半枝莲多糖（SBP、SBP1、SBP2、SBPⅠ、SBP-L、SBP-L1和SBP-L2）的体外抗氧化活性进行了研究:采用邻苯三酚自氧化方法,测定半枝莲多糖对O2-自由基的抑制作用;采用邻二氮菲-亚铁离子—H2O2体系测定了半枝莲多糖对羟基自由基的抑制作用;体外模拟胃液pH值条件下测定了半枝莲多糖对NO2-清除能力。结果表明,七种多糖均具有不同的抗氧化活性,呈剂量依赖关系。半枝莲多糖SBP的抗氧化性要强于分离后的多糖SBP1和SBP2,硫酸化修饰后的多糖SBP-L和SBP-L2的抗氧化性较原多糖SBP和SBP2的抗氧化性增强,多糖SBP-L1较多糖SBP1对羟基自由基和NO2-的清除效果有所降低,对O2-自由基清除效果有所提高。本文研究表明,几种半枝莲多糖都具有不同百分比的β—（1→3）葡聚糖苷键,因此,七种多糖出现不同程度的抗氧化性。