桑叶提取物通过NF-κB信号通路改善KKAy小鼠胰岛素抵抗的机制研究

研究背景目前,世界上超过1.5亿人为2型糖尿病患者,到2020年人数将会增加2倍。2型糖尿病患者大多体型肥胖,且常伴有高脂血症,如果治疗不当会导致严重的并发症,如肾衰、失明、视神经炎、伤口愈合慢、动脉病(包括冠状动脉疾病)等。目前国内外许多学者认为2型糖尿病可能是由炎症细胞因子介导的一种免疫性疾病,此观点被称为2型糖尿病的“炎症学说”,2型糖尿病的炎症机制自此成为糖尿病学者研究的热点。研究者发现,炎症因子的过度分泌及炎症通路的持续激活导致的慢性炎症状态,可能诱发胰岛素抵抗以及糖尿病的发生。细胞核因子KappaB(NF-κB)是广泛分布于细胞的核转录因子,在炎症反应过程中起重要作用。IκBα是转录因子NF-κB的抑制剂,由于IκBα的存在,NF-κB在细胞质中处于静止状态；许多细胞外免疫刺激物诱导IκKβ活化,作用于IκBα使其磷酸化,诱导NF-κB与IκBα解离,NF-κB被活化,进入细胞核,调控相关炎性因子的表达,过度表达的促炎因子是导致胰岛素抵抗的一个重要因素。研究桑叶提取物对高胰岛素诱导的HepG2细胞及自发性2型糖尿病KKAy小鼠中NF-κB信号通路的影响,在2型糖尿病的治疗过程中具有重要临床意义。目前,用于治疗2型糖尿病药物分为胰岛素和口服降糖药,口服降糖药主要分为如胰岛素促泌剂、胰岛素增敏剂、α-葡萄糖苷酶抑制剂以及双胍类等传统降糖药；随着药物的发展一些新型降糖药也已逐渐进入临床使用,如：GLP-1激动剂---艾赛那肽和利拉普泰,DPP-4抑制剂---西格列汀和维格列汀,SGLT-2抑制剂和GPR119激动剂等,但这些新药仅仅通过几千例患者,可能会掩盖很多情况,对于其实际疗效、安全性及副作用还有待于临床积累资料,因此目前临床还是主要采用传统降糖药,但西药治疗虽然能从表面快速降低血糖,但不能从根本上降低糖尿病的发生,而且还存在许多副作用,因此寻找降糖中药成了新的治疗策略。中药作为中国特色的传统医药,在治疗2型糖尿病及其并发症方面进行了大量的实践,同时积累了大量的临床经验,已被广泛用于2型糖尿病的治疗,是进一步研究和开发降糖新药的宝贵资源。桑叶为桑科植物桑的干燥叶,属甘寒之品,具有降血压、血脂、抗炎等作用,在民间曾广泛用于治疗消渴病,本课题组也一直致力于桑叶降糖的研究,从原材料的选取,桑叶有效提取物的提取分离及纯化,到降糖机制,进行了一系列的研究。根据文献分析及课题组前期研究基础,本文章分别以HepG2细胞及自发性2型糖尿病KKAy小鼠为研究对象,观察桑叶生物碱(Mulberry leaves Alkaloids,MLE)、桑叶多糖(Mulberry leaves polysaccharides, MLP)、桑叶黄酮(Mulberry leaves flavonoids,MLF)对高胰岛素诱导HepG2细胞及自发性2型糖尿病KKAy小鼠NF-κB信号通路相关基因、蛋白及炎症因子表达的影响,探讨桑叶提取物对2型糖尿病可能产生的保护作用,以便为其临床应用提供理论及实验依据。具体如下：第一部分桑叶提取物对IR-HepG2细胞NF-κB信号通路相关基因表达的影响目的建立HepG2细胞的胰岛素抵抗模型,探讨桑叶有效部位对模型细胞IκBα、IκKβ基因mRNA表达及NF-κB活化的影响。方法以人肝癌HepG2细胞为研究对象,10μgm·L-1胰岛素培养基中诱导培养48 h,建立胰岛素抵抗的HepG2细胞(IR-HepG2)模型；将IR-HepG2模型细胞随机分为模型组,总多糖组,总黄酮组,总生物碱组,罗格列酮组,分别体外培养胰岛素抵抗的HepG2细胞,另以HepG2细胞作为正常对照组,cck8法检测胰岛素抵抗的HepG2细胞的增值,葡萄糖氧化酶法(GOD-POD)检测细胞上清液中葡萄糖含量,确定各实验组的最佳干预浓度。RT-qPCR法检测IKKβ、Iκ Bα mRNA的表达,Western Blot法检测IκBα蛋白表达反映NF-kB的活性。结果高胰岛素诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗后,IKKβ表达量明显增加,NF-κB活性增加；应用桑叶提取物干预后,桑黄酮、多糖、生物碱可以降低IKKβ mRNA、IκBα mRNA的表达；且桑黄酮、生物碱可以抑制IκBα降解,抑制NF-κB的活性。结论高胰岛素诱导HepG2细胞发生胰岛素抵抗后,NF-κB信号通路在一定程度上被激活,表明胰岛素抵抗与NF-κB炎症通路间存在一定的关系；桑叶提取物能够抑制NF-κB的活化,从而为桑叶用于临床防治2型糖尿病提供了一定的理论依据。第二部分桑叶提取物对自发性2型糖尿病KKAy小鼠糖代谢的影响目的观察桑叶各提取物(多糖,黄酮,生物碱)对自发性2型糖尿病KKAy小鼠糖代谢的影响。方法预实验确定各药物组给药剂量。根据体重、血糖将KKAy小鼠随机分为5组,分别设模型组(IR),桑多糖(MLP,1000 mg·kg-1)、桑黄酮(MLF,1000mg·kg-1)、桑生物碱(MLA,30mg·kg-1)和罗格列酮(RSG,2mg·kg-1),每组各6只,另以10只C57BL/6小鼠为正常对照组(NC)。实验中, KKAy小鼠喂饲专属饲料,C57BL/6小鼠喂饲普通饲料,各给药组灌胃给药,模型组与正常组以纯水灌胃,1次/d,共4周,每周记录1次体质量,每周每组随机取2-3只小鼠测定空腹血糖。末次给药后1h,水合氯醛腹腔麻醉,打开腹腔,迅速剥离肝脏、附睾脂肪,称重,计算肝脏和附睾脂肪系数,置于液氮中保存用于检测各实验组肝糖原含量。结果桑叶各提取物(多糖,黄酮,生物碱)均能够降低KKAy小鼠体重,肝脏指数以及附睾脂肪系数,降低附睾脂肪重量,不同程度改善KKAy小鼠的空腹血糖水平,明显增加肝糖原含量,与模型组比较有统计学差异(P<0.05)。结论桑叶各提取物(多糖,黄酮,生物碱)可减轻自发型2型糖尿病KKAy小鼠体重,降低空腹血糖,增加肝糖原含量,有利于血糖的长期稳定控制,同时抑制小鼠由于高糖状态而引起的肝脏,脂肪组织肿大。第三部分桑叶提取物对自发性2型糖尿病KKAy小鼠血清因子的影响目的观察桑叶提取物(多糖,黄酮,生物碱)自发性2型糖尿病KKAy小鼠血清炎症因子IL-6、CRP以及TNF-α的影响。方法随机将KKAy小鼠分为5组,分别设模型组(IR),桑多糖(MLP,1000mg/kg)、桑黄酮(MLF,1000mg/kg)、桑生物碱(MLA,30mg/kg)和罗格列酮(RSG,2mg/kg),每组各6只,另以10只C57BL/6小鼠为正常对照组(NC)。实验干预如上。末次给药后1h,水合氯醛腹腔麻醉,断头取血,3000r/min,离心15min,取血清,-70℃保存。按照ELISA试剂盒进行检测。结果与正常对照C57BL/6小鼠相比,模型组KKAy小鼠血清IL-6、CRP、以及TNF-α含量明显增加(P<0.01)；桑叶干预4周后,与模型组比较,各给药组KKAy小鼠血清IL-6、CRP、TNF-α含量明显降低(P<0.05)。结论桑叶通过调节血清IL-6、CRP以及TNF-α的水平,减轻KKAy小鼠的胰岛素抵抗,从而恢复正常代谢。第四部分桑叶提取物对自发性2型糖尿病KKAy小鼠肝脏及附睾脂肪组织中蛋白IκKβ、p-IκBα表达的影响目的探讨桑叶提取物(多糖,黄酮,生物碱)对自发性2型糖尿病KKAy小鼠肝脏及附睾脂肪组织中蛋白IκKβ、p-IκBα表达的影响。方法从液氮中拿出肝脏及附睾脂肪组织,放入研钵中,液氮研磨成粉末,加入组织裂解液和蛋白酶抑制剂的混合物继续研磨至匀浆,RIPA裂解取上清,即蛋白液。BCA法检测蛋白浓度,Western Blot法检测两种组织中蛋白IκKβ、 p-IκBα表达。结果与正常对照组(NC)相比,模型组KKAy小鼠肝脏及附睾组织中蛋白IκKβ、p-IκBα表达升高(P<0.01)；药物干预后,与模型组相比,各实验组肝脏及附睾组织中蛋白IκKβ、p-IκBα表达降低(P<0.05),IκBα降解明显被抑制。结论自发性2型糖尿病KKAy小鼠肝脏及脂肪组织中NF-κB炎症信号通路被激活,IκKβ及IλBα蛋白的磷酸化水平升高,桑叶提取物(多糖,黄酮,生物碱)能显著降低肝脏及附睾脂肪组织中蛋白IκKβ的表达及IκBα蛋白的磷酸化水平。