目的原发性胆汁性肝硬化(primary biIiary cirrhosis,PBC)是一种自身免疫性疾病,常见于中年女性,病理改变主要以肝内细小胆管的慢性非化脓性破坏、汇管区炎症、慢性胆汁淤积、肝纤维化为特征。其发病机制尚不完全清楚,可能与自身免疫、感染和细胞病变有关。本课题运用多元统计学方法针对原发性胆汁性肝硬化患者的中医证型进行初步研究,并通过聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,poly I:C)建立原发性胆汁性肝硬化小鼠模型,通过观察小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Tregs及肝组织病理的变化探讨调肝理脾方(Tiaogan Lipi Decotion,TGLP)防治原发性胆汁性肝硬化病变的作用机制。方法1临床研究根据原发性胆汁性肝硬化的临床特点及中医临床四诊信息,采用临床流行病学调查方法,采集105例原发性胆汁性肝硬化患者症状、体征、舌象、脉象等中医四诊信息;应用系统聚类、主成分分析与因子分析相结合的方法进行统计学处理。2实验研究采用随机数字表法取30只C57BL/6小鼠作为正常对照组常规饲养。剩余150只小鼠随机分为模型对照组、阳性对照组(0.1g·kg-1·d-1)、TGLP低剂量组(13.5g·kg-1·d-1)、TGLP中剂量组(27.0g·kg-1·d-1)、TGLP高剂量组(54.0g·kg-1·d-1),每组30只,均给予Poly I:C 5mg·kg-1腹腔注射,2次/周,直至24周。造模同时阳性对照组和TGLP组小鼠按20ml·kg-1的体积灌胃相应药物,正常对照组及模型对照组给等体积蒸馏水,1次/日,共24周。于给药后8、16、24周颈脱位法处死小鼠(处理前禁食1天),每个时间点10只,采集小鼠血清、肝脏以备检测。以酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗线粒体抗体M2亚型(AMA-M2),流式细胞术分析各组外周血T淋巴细胞中cd4+cd25+foxp3+treg细胞所占比例,he染色、masson三色染色法观察肝组织病理变化,免疫组织化学法观察ck19的变化。结果1临床研究对所收集到的105例原发性胆汁性肝硬化患者的中医症状进行多元统计学方法,结果显示原发性胆汁性肝硬化的中医证型可归纳为肝郁脾虚、水湿内阻和肝肾阴虚兼气滞血瘀3种病机。2实验研究①随着造模时间的延长正常对照组小鼠ama-m2始终为阴性,余各组小鼠ama-m2阳性率呈逐渐增加趋势,24周结束时模型对照组ama-m2阳性率为90%,与模型对照组比较,tglp各剂量组及阳性对照组阳性率均有所降低。②随着造模时间的延长,模型对照组小鼠外周血cd4+cd25+foxp3+tregs所占的比例均低于同期正常对照组(p<0.05),正常对照组、模型对照组、tglp高剂量组小鼠外周血cd4+cd25+foxp3+tregs所占的比例均呈下降趋势,tglp中剂量组小鼠外周血cd4+cd25+foxp3+tregs所占的比例,随着造模时间逐渐升高,第24周与同期正常对照组小鼠,差异无统计学意义(p>0.05)。③肝组织病理显示正常对照组肝小叶结构清晰,汇管区未见明显蓝绿色胶原纤维分布。模型对照组肝小叶结构紊乱,胶原纤维明显增多,个别出现索条状增生,但未见形成假小叶。与模型对照组比较,tglp高、中剂量及阳性对照组均有所改善。免疫组化结果显示正常对照组ck19表达于小胆管,周围无淋巴细胞浸润及胆管增生。模型对照组肝组织ck19表达明显,随着造模时间的延长,汇管区和纤维间隔内阳性胆小管数量明显增加,管腔小而畸形,24周结束时肝内小胆管破坏,可见散在分布的ck19阳性细胞,周围淋巴细胞浸润。与模型对照组比较,tglp高、中剂量及阳性对照组ck19表达有所降低。结论1多元统计方法使原发性胆汁性肝硬化的中医证候特点研究更为标准化、客观化和规范化。2以polyi:c腹腔注射c57bl/6小鼠可成功建立原发性胆汁性肝硬化动物模型。3 TGLP可能通过提高外周血调节性T细胞来维持免疫耐受状态,从而来减缓原发性胆汁性肝硬化的疾病进展。4 TGLP组能改善PBC小鼠肝组织汇管区炎症和纤维化程度,减少胆小管增生,且疗效优于阳性对照组。
