乌拉草多糖的提取纯化、结构表征及生物活性研究

乌拉草（Carex meyeriana Kunth）属于莎草科（Cyperaceae）薹草属（Carex）植物,广泛分布于中国东北部,并且具有保暖和改善血液循环的功能,具有较高的研究价值。通过文献检索,目前,乌拉草的研究主要集中在挥发油和黄酮化合物上,乌拉草多糖的研究尚未进行系统的研究。本文以乌拉草为原材料,对乌拉草多糖的提取、纯化、分离、结构表征和生物活性进行了系统的研究,为深度开发乌拉草提供了理论依据。研究方法与主要成果如下:利用响应面法（RSM）对乌拉草多糖的热水提取工艺进行了优化,同时对比微波辅助提取法和超声辅助提取法。热水提多糖（HWEP）、微波提多糖（MAEP）和超声提多糖（UAEP）的初步结构表征采用了高效液相色谱（HPLC）、红外光谱（FTIR）和紫外分光光度法（UV-Vis）。通过测定DPPH自由基、羟基自由基和ABTS+自由基清除活性来评价三种多糖的抗氧化活性。实验结果表明,热水提取法、微波辅助提取法和超声辅助提取法的多糖提取率分别为0.47±0.01%、0.28±0.02%和0.25±0.02%,热水提取法的提取率最高。HWEP和MAEP均由Rha:Xyl:Arab:Fru:Glu:Gal组成,摩尔比分别为1.05:1.21:3.86:1:3.61:4.5和1:1.95:1.72:1.78:4.36:6.18。UAEP由Rha、Xyl、Arab、Fru、Man、Glu、Gal组成,摩尔比为1:2.31:5.23:1.05:3.17:4.17:7.89。HWEP、MAEP和UAEP的分子量分布分别为16 kDa1698 kDa、15 kDa913 kDa和17 kDa1118 kDa。红外光谱扫描及其二阶导数分析也证明了不同提取方法所得多糖的存在差异。抗氧化活性研究表明,三种方法提取的多糖均具有较高的清除DPPH自由基、羟基自由基和ABTS+自由基的活性,其中HWEP抗氧化活性优于其他两种。因此,HWEP具有较高的研究价值。采用静态吸附试验对比了AB-8、D101、S-8、X-5和NKA-Ⅱ五种大孔树脂对乌拉草多糖的纯化效果,最终筛选出AB-8大孔吸附树脂更适用于纯化乌拉草多糖;利用大孔吸附树脂对HWEP进行纯化,并结合层次分析法（AHP）和响应面优化法（RSM）对乌拉草多糖纯化工艺进行了优化。层次分析的结果显示大孔吸附树脂纯化的多糖回收率、脱蛋白率和脱色率的权重系数分别为0.515、0.372和0.113;多糖纯化的最佳工艺条件为:洗脱体积为2.74 BV,流速为1.88 BV/h,样品浓度为2.10 mg/mL,最大预测综合得分可达64.02%。最佳纯化工艺下多糖回收率、脱蛋白率、脱色率分别为49.63±1.24%、82.06±2.17%和66.43±1.51%。利用阴离子交换DEAE-52纤维素对纯化后的乌拉草多糖进行分离;采用PMP柱前衍生化法、凝胶色谱分析法、UV-Vis和FTIR进行结构表征;以RAW264.7细胞为研究对象,对多糖的免疫调节活性进行了研究。获得了CMKP-1和CMKP-2两个组分的乌拉草多糖;CMKP-1和CMKP-2均由Man、Rib、Rha、GluA、GalA、Glu、Gal、Xyl、Arab和Fuc组成,摩尔比分别为8.93:1:4.62:1.41:1.78:10.7:24.69:4.51:15.92:1.27和7.85:1:5.05:1.99:3.15:12.47:15.41:1.54:6.91:3.15。CMKP-1和CMKP-2的主要分子量分别为22.30 kDa和48.10 kDa。FTIR揭示了CMKP-1和CMKP-2的多糖特征吸收峰。刚果红试验表明,CMKP-1和CMKP-2具有三螺旋构象。免疫调节实验结果显示了在一定浓度范围内,CMKP-1和CMKP-2对RAW264.7细胞均具有较好的免疫调节作用,可作为一种潜在的免疫调节剂。