热毒宁注射液由金银花(Lonicera Japonica)、栀子(Gardenia Jasminioides)、青蒿(Artemisia Annua)三味中药制备而成,具有清热、疏风、解毒之功效,主要用于上呼吸道感染(URTI)的治疗。前期药理研究表明其有多种药理作用,可降低多种呼吸道病毒载量、抑制PGE2、IL-1、ET等多种炎症因子分泌；临床研究显示能明显缓解上呼吸道感染(URTI)患者的高热、咳嗽等症状。但其治疗URTI的分子机制目前尚不清楚,根据已报道的部分成分作用机制研究和相应的中医理论,疾病是机体整体功能的失衡,中药作用在于调整失衡状态恢复到平衡状态(健康),故推测其作用机制可能是所含活性成分对整个疾病网络的整体调控。
本文采用主成分分析、分子对接、网络分析以及体外细胞实验等方法对分析了热毒宁注射液中化学成分的空间结构分布、进行了化学分子和与URTI发病机制相关靶蛋白的分子对接,计算了靶蛋白与化学分子的相互作用网络特征,进而预测出热毒宁注射液治疗URTI的分子作用机制、主要活性成分群和可能的适应症,并从细胞水平和蛋白表达水平对所预测的热毒宁注射液抗炎、抗流感病毒分子机制进行了初步的试验验证。通过尝试运用网络药理学研究思路对热毒宁注射液治疗URTI的作用机制探索,明确了热毒宁注射液多组分、多靶点、多途径的作用机制,为其更好的临床应用提供理论支撑,也是对网络药理学在中药作用机制研究方面的有益探索。
1.热毒宁注射液化学分子和URTI靶蛋白数据库构建
根据URTI发病机制分析和前期热毒宁注射液化学成分的系统研究,通过TTD、 DrugBank、PDB、Bestelin、UNPD等数据库检索到含有原配体的51个靶蛋白晶体结构和58个化合物的78个化学分子的三维结构。利用DiscoveryStudio2.5中General Purpose对化学分子的分子描述符,并通过与已上市的用于治疗URTI的38个药物进行化学结构相似分析,发现热毒宁注射液中绝大部分化学成分具有较好的类药性和较好的生物利用度,其与治疗URTI的药物在化学结构上有较大的相似性,提示所选择的化合物包含了热毒宁注射液治疗URTI的活性化合物,同时也说明了热毒宁注射液中含有与治疗URTI相关的活性化合物。
2.热毒宁注射液分子对接与网络分析
应用Autodock计算化学分子与靶蛋白,再以原配体为阂值,取对接分值较高的化合物(score>=5)导入Cytoscape2.8.1构建生物网络,并通过网络特征分析(包括网络度、介数、网络密度等)发现：a)有25个化学分子与3个以上的靶蛋白存在较强相互作用,其中7个分子对网络的影响比较大(介数比较高),且与7个以上靶蛋白存在作用,而这些靶蛋白分布于病毒复制、炎症介质分泌以及胞内信号转导等环节,推测这些分子在热毒宁注射液治疗URTI中有极重要的地位；b)有4个小分子在分子-分子网络中处于桥连点的位置,有助于保证网络中不同模块间的信息流通,推测其在热毒宁注射液中与其它分子可能存在协同作用：c)靶点分析表明热毒宁注射液缓解URTI症状的分子机制可能是抑制病毒(流感病毒、鼻病毒以及呼吸道合胞病毒等)胞内复制、调控MAPKs、PI3K-Akt、JAK-STAT、 NF-kB信号通路、降低炎症因子(IL-1、 IL-6、NO、PGE2等)分泌,最终促进炎性机体恢复到平衡状态。
3.热毒宁注射液分子抗炎、抗病毒活性验证
通过测定热毒宁注射液中28个化合物对LPS刺激RAW264.7释放PGE2、NO的抑制作用,发现16个活性化合物(抑制率>=50%)；结合预测结果可知,其中9个可能是通过调控MAPKs、JAK、NF-kB信号通路影响COX、 mPGES-1、iNOS的表达或/和直接抑制PLA2、COX、mPGES-1、iNOS酶的活性来降低PGE2、NO含量,而进一步对COX-2、 mPGES-1、iNOS蛋白表达的分析发现在预测可调控MAPKs、JAK信号通路的(RDN3、 RDN4、 RDN5、RDN11、RDN18、RDN22、RDN27)7个化合物中,5个化合物(RDN3、 RDN5、RDN18、RDN22、RDN27)被证实其抑制PGE2、 NO分泌的作用与降低的COX-2、 mPGES-1、iNOS蛋白表达有关。
通过对热毒宁注射液中28个化合物的抗流感病毒实验发现,与HA、NA、SAH、IMP dehydrogenase等多个病毒复制环节蛋白存在相互作用的RDN11对A型流感病毒有较强的抑制活性(EC50=28.44μM, SI=24.66),而与HA、IMP dehydrogenase有相互作用但对整个生物网络影响较小的RDN14对A型流感病毒有较弱的抑制活性(EC50=91.284μM,SI=5.48)。
两次验证结果表明,基于网络药理学研究思路下的热毒宁注射液分子对接与网络分析预测中药分子与靶蛋白的相互作用,结合以生物途径为基础的实验验证是一种阐释复方中药作用机制较为有效的方法,该方法的建立为复方中药的效应物质基础及作用机制研究起着积极作用。
