玉米赤霉烯酮胶体金免疫层析试纸条的研制

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是一类由镰刀菌产生的次生代谢物,广泛存在于玉米、大麦、燕麦、小麦、大米和高粱等作物中。它不仅影响农作物的经济和营养价值,还对人畜有一定的毒害作用。目前,用于检测玉米赤霉烯酮的分析方法主要有色谱检测法、免疫检测法。其中,免疫检测法灵敏度更高,专一性较强,成本低,应用范围更广。免疫检测法中的胶体金免疫层析试纸条法可以快速检测,更方便实用。本研究是在实验室前期筛得的抗玉米赤霉烯酮杂交瘤细胞的基础上制备单克隆抗体,进一步制备可以快速检测玉米、小麦等作物中ZEN的胶体金免疫层析试纸条,对该胶体金免疫层析试纸条质量进行评价。本论文主要包括三部分。第一部分为包被抗原以及单克隆抗体的制备。包被抗原合成分两步,首先ZEN与羧曱基羟胺半盐酸盐一步合成半抗原,第二步活泼脂法与卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)偶联合成全抗原。半抗原的鉴定是通过薄层层析法(Thin Layer chomatography,TLC)和电喷雾离子化质谱法(Electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS)技术,全抗原是采用紫外光谱法进行检测。通过体内收集腹水法用实验室前期获得的杂交瘤细胞株3D 10制备单克隆抗体,再用饱和硫酸铵沉淀法纯化得到单克隆抗体,效价为1×106,蛋白浓度约为3873 μg/mL。第二部分为制备胶体金免疫层析试纸条。采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为30nm的胶体金,通过肉眼观察法、可见光光谱法、透射电镜三种方法鉴定胶体金质量,结果表明胶体金粒径为30 nm,颗粒均匀。制备金标抗体,通过肉眼观察法确定胶体金的最适pH值为7.5,偶联抗体的最适量为9.6μg。硝酸纤维膜millipore 135为试纸条的检测区,检测限处包被抗原浓度及控制线处羊抗鼠IgG的最适浓度均为1 mg/mL。将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装起来,制成胶体金免疫层析试纸条。第三部分为胶体金免疫层析试纸条质量评价与应用。对胶体金免疫层析试纸条的交叉反应性、最低检测限以及稳定性进行评价。该胶体金免疫层析试纸条与其他霉菌毒素如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、HT-2毒素、T-2毒素、黄曲霉毒素B1(AFB1)无交叉反应性,特异性较好;与四种类似物α-玉米赤霉烯醇(α-ZOL),β-玉米赤霉烯醇(β-ZOL),α-玉米赤霉醇(α-ZAL)和β-玉米赤霉醇((3-ZAL)存在交叉反应性;最低检测限为30 μg/kg;在37℃保质期为2 d,在4℃条件下的保质期大于1周。使用该胶体金免疫层析试纸条和HPLC-MS/MS两种方法检测10份样品,7份样品ZEN浓度高于30μg/kg,试纸条检测呈阳性,检测结果与HPLC-MS/MS结果一致。