黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条的研制

黄曲霉毒素B1(aflatoxinB, AFB1)是寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和黄曲霉(A.flavu)的二次代谢产物,具有很强的致癌性。许多粮油食品、饲料等都容易被AFB1污染,严重威胁人类健康和畜禽生产。几乎所有国家和地区都规定了农产品、食品和饲料中AFB1的最大允许含量,并作为强制性检测标准进行检测。目前的检测方法大多需要专门的仪器设备并且操作繁琐,无法满足现场快速检测的要求,因此建立简单、快速、高效的AFB1检测方法具有重要的意义。 本研究以单克隆抗体(McAb)和免疫胶体金标记技术(ILT)为基础,根据竞争抑制原理,成功研制了AFB1胶体金免疫层析试纸条,其灵敏度、特异性、稳定性等基本能达到检测要求。 (1)将稳定分泌抗AFB1单克隆抗体的杂交瘤细胞株2A5接种于BALB/c小鼠腹腔,采用体内诱生腹水法制备抗AFB1的腹水。腹水经辛酸-硫酸铵法纯化并作质量鉴定,考马斯亮蓝法测定单抗蛋白质浓度为1.526 mg/mL;酶联免疫吸附法(ELISA)测定抗体效价为1：6.4×104,IC50为0.218 ng/mL;交叉反应结果表明单抗特异性良好。 (2)采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以金标AFB1单克隆抗体作为探针,将AFB1-BSA(检测线)和羊抗鼠IgG(质控线)分别包被在硝酸纤维素膜上,构建了间接竞争胶体金免疫层析检测体系(GICA)。标记探针中金溶胶最佳粒径为24 nm,最佳包被抗原浓度为0.3 mg/ml,金标单抗量为0.5μg/mL,金标液的最佳稀释度为4倍稀释。GICA目测检出限为5 ng/mL,检测时间为5～10 min。试纸条对AFB2、AFM1、赭曲霉毒素B、玉米赤霉烯酮等无交叉反应,与AFG1、AFG2有明显的交叉反应。 (3)在AFB1加标回收实验中,将6种不同浓度(1、2、3、5、10、20ng/mL)的AFB1标准品添加到未污染AFB1的玉米粉中,制备不同污染程度的样品。分析比较GICA法和ELISA法对AFB1的检测情况。当添加的AFB1浓度低于2ng/mL时,检测线和质控线均为红色；高于3 ng/mL时,仅质控线为红色,同时以ELISA法做验证实验,结果表明试纸条能够基本满足检测要求。 试纸条检测的最大优点是无需借助仪器,所需试剂已固定在试纸条上,检测快速、简便,10min内可出检测结果,适用于对AFB1进行现场检测。