黄曲霉毒素B1高灵敏度检测技术研究

黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）危害极大，广泛存在于各种农产品、食品和饲料中，严重威胁人类和动物的生命安全。世界各国设置极其严格的限量标准，造成技术性贸易壁垒，研究建立高灵敏度的AFB1检测技术，对实施从农田到餐桌的农产品质量控制管理措施，破解技术壁垒，及时发现和剔出受AFB1污染的产品，防止AFB1含量超标的产品进入食物链具有重要意义。 本研究根据AFB1的荧光特性，研究提高AFB1检测灵敏度的方法：采用激光光源进行激光诱导荧光，建立高灵敏度LIF-HPCE AFB1检测技术；提出AFB1配合物的荧光增强效应，研究新型HgCl2荧光增强剂；建立高灵敏度HPLC柱后HgCl2衍生AFB1检测技术；应用HgCl2的荧光增强效应，建立AFB1免疫亲和柱净化-荧光快速定量检测技术。主要结论如下： 1．采用375nm小功率（20mW）半导体泵浦固体激光器作为新型的激发光源，与HPCE耦合，搭建了AFB1高灵敏度检测平台，以MECC分离模式对AFB1检测，大大提高灵敏度。缓冲溶液：50mmol／L NaDC，6mmol／L Na284O7，10mmol／LNa2HPO4，10％乙腈；λex=375nm，λem=440nm，操作电压15kV，电流104μA，毛细管柱直径75μm，柱长度57 cm，到检测窗口距离50cm。方法精密度RSD＜3％，重复性RSD＜5％，回收率为84.1％-96.1％，R2=0.9988。最低检出质量0.17pg，最低定量限0.56pg，绝对检出量的灵敏度提高了3个数量级，显著高于其他方法。 2．通过研究AFB1与多种金属离子荧光体系荧光值变化情况，确定HgCl2是一种新型的AFB1荧光增强剂。室温下Hg（Ⅱ）与AFB1混匀，反应摩尔比大于1：1时，荧光增强反应体系2min内快速、稳定达到平衡，完成最大增强。比传统的荧光增强剂Br2水增强程度高2倍以上，大大提高了AFB1的检测灵敏度；验证了Hg（Ⅱ）离子与AFB1形成配合物荧光增强效应，发生AFB1到Hg（Ⅱ）的LMCT跃迁，通过光氧化还原反应，形成稳定的配合产物，使反应物体系中刚性结构加强，共轭体系增加，荧光效率提高，荧光值大大增强。 3．采用HgCl2对AFT特别是AFB1、AFG1、AFM1进行柱后衍生，建立高灵敏度HPLC柱后HgCl2衍生检测技术。流动相为甲醇—乙腈—水（22：18：60 v：v：v），荧光检测器检测（λex=365nm，λem=440nm），柱温30℃，流动相流速0.8mL／min；柱后衍生试剂流速0.4mL／min，进样量10μL，可以在13min内同时分离检测五种主要的AFT（B1，B2，G1，G2和M1）。AFB1的最低检出限和最低定量限分别达到了0.05μg／kg和0.17μg／kg，最低检出质量为0.5pg，绝对检出量的灵敏度提高超过了2个数量级。重复性RSD为1.81％，低于5％；精密度RSD为4.28％，在5％以下；回收率为84.67-91.10％，RSD＜5％。方法成功分析污染花生，花生酱，花生油，大米，玉米等农产品中的黄曲霉毒素，是检测农产品和食品中黄曲霉毒素可靠有效的方法。 4．将HgCl2荧光增强效应引入AFB1免疫亲和快速测定技术中，建立了一套快速、准确、简易的IAC前处理技术，用于农产品及食品中AFB1，大大提高了速测技术的检测灵敏度，最低定量限0.3μg／kg，同收率＞90％，单个样品制备在40min之内，RSD＜3％，R2＞0.99，具有操作简单，速度最快，费用最低，准确度高，检测结果直接读数的特点，对环境及检验人员安全性最高，适于现场和口岸检测。