基于IL-1β/MAPKs通路探讨威灵仙总皂苷对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

目的:建立兔膝骨关节炎(OA)动物模型及软骨细胞体外培养体系,观察威灵仙总皂苷(TSC)对软骨细胞凋亡的影响,探讨TSC通过IL-1β/MAPKs信号通路干预兔膝OA软骨细胞凋亡的机制。方法:1、TSC对兔膝OA IL-1β/MAPKs信号通路及软骨细胞凋亡影响的在体实验健康雄性新西兰大白兔48只,随机分为两组:空白组及模型组,每组分别有兔8只、40只,模型组采取石膏管型固定(左后肢膝关节伸直位)造模,造模成功后,模型组兔随机分为5组:模型对照组,TSC低剂量组、TSC中剂量组、TSC高剂量组及塞来昔布组,每组8只。空白组及模型对照组,每日抽取10毫升生理盐水灌胃,TSC低、中、高剂量组分别按25mg/Kg/d、50mg/Kg/d.100mg/Kg/d灌胃,塞来昔布组每日灌胃剂量为10mg/Kg。6周后处死动物,取膝关节软骨多聚甲醛固定、石蜡包埋,HE染色观察软骨组织的形态结构,ELISA法检测软骨组织内IL-1β的浓度。RT-PCR法检测软骨组织内Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的基因表达。Western-blot法检测软骨组织p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表达。2、TSC对IL-1β作用下软骨细胞凋亡及MAPKs信号通路影响的离体实验(1)健康4周龄新西兰大白兔20只,取膝关节软骨组织,建立兔膝软骨细胞体外培养体系,甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞,显微镜下观察软骨细胞的形态。(2)取第3代软骨细胞,随机分为正常组,IL-1β组、IL-1β+TSC组1(TSC浓度为25μg/m L)、IL-1β+TSC组2(TSC浓度为50μg/m L)、IL-1β+TSC组3(TSC浓度为100μg/m L)、IL-1β+TSC组4(TSC浓度为200μg/m L)、IL-1β+TSC组5(TSC浓度为400μg/m L),各组IL-1β浓度均为10ng/m L,分别干预24h、48h,72h、96h后,MTT法检测软骨细胞的活性,筛选TSC对IL-1β作用下的软骨细胞最佳干预浓度和时间。(3)选取第3代软骨细胞,随机分为空白组、IL-1β组(10ng/m L)、IL-1β+TSC组(IL-1β浓度为10ng/m L、TSC浓度为MTT法确定的最佳干预浓度),依确定的最佳干预时间干预后,收集软骨细胞,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡。RT-PCR法检测软骨细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的基因表达。Western-blot法检测各组软骨细胞p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表达情况。结果:1、TSC对兔膝OAIL-1β/MAPKs信号通路及软骨细胞凋亡影响的在体实验(1)模型组动物X片示,关节间隙不对称,关节间隙狭窄,关节面不光整,关节周围骨质硬化,有骨赘形成,造模成功。干预6周后,HE染色结果表明不同浓度的TSC和塞来昔布均可以明显促进膝OA软骨组织的修复,TSC高剂量组效果最佳;各组软骨组织内IL-1β的水平,模型对照组明显高于空白组IL-1β水平(P<0.05),TSC低剂量组、TSC中剂量组及TSC高剂量组明显低于模型对照组(P<0.05),随着TSC浓度增加,IL-1β的水平逐渐降低,TSC高剂量组IL-1β水平明显低于塞来昔布组(P<0.05)。(2)干预6周后,各组软骨组织内Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9m RNA表达:Bcl-2 m RNA,模型对照组明显低于空白组(P<0.05),TSC低剂量组、TSC中剂量组及TSC高剂量组明显高于模型对照组(P<0.05),TSC中剂量组明显高于TSC低剂量组(P<0.05),TSC高剂量组明显高于TSC中剂量组(P<0.05),塞来昔布组明显低于TSC高剂量组(P<0.05);Bax m RNA表达,模型对照组明显高于空白组(P<0.05),TSC低、中剂量组与模型对照组比较没有显著性差异(P>0.05),TSC高剂量组及塞来昔布组明显低于模型对照组(P<0.05),TSC高剂量组与塞来昔布组比较无显著性差异(P>0.05);Caspase-3、Caspase-9 m RNA表达,模型对照组明显高于空白组(P<0.05),TSC低剂量组、TSC中剂量组、TSC高剂量组、塞来昔布组均明显低于模型对照组(P<0.05);Caspase-3 m RNA表达,TSC低剂量组、TSC中剂量组、塞来昔布量组之间无明显差异(P>0.05),但TSC高剂量组明显低于TSC低、中剂量组及塞来昔布组;caspase-9 m RNA表达,TSC低剂量组、TSC中剂量组、TSC高剂量组之间有明显差异(P<0.05),TSC高剂量组与塞来昔布组比较无明显差异(P>0.05)。(3)干预6周后,各组软骨组织内p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表达:p-P38、p-ERK-1及p-ERK-2蛋白表达,模型对照组明显高于空白组(P<0.05);TSC低剂量组、TSC中剂量组、TSC高剂量组及塞来昔布组明显低于模型对照组,其中尤以TSC高剂量组最低(P<0.05);随着TSC浓度的不断增加,p-ERK-1、p-ERK-2蛋白表达均逐渐减低,而且各组之间均有明显不同(P<0.05);p-P38蛋白表达,TSC中剂量组和TSC低剂量组无明显差异(P>0.05),TSC高剂量组显低于TSC中剂量组(P<0.05)。2、TSC对IL-1β作用下软骨细胞凋亡及MAPKs信号通路影响的离体实验(1)第一代、第二代、第三代软骨细胞生长良好,原代软骨细胞经甲苯胺蓝染色后,软骨细胞呈异染性。(2)MTT法筛选TSC对IL-1β作用下兔第3代软骨细胞干预的最佳浓度为200μg/m L,最佳干预时间为72小时。(3)各组软骨细胞凋亡率:IL-1β组明显高于空白组软骨细胞凋亡率(P<0.05),IL-1β+TSC组明显低于IL-1β组(P<0.05)。(4)各组第三代软骨细胞干预72小时后Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9 m RNA表达:Bcl-2 m RNA表达,IL-1β组明显低于空白组(P<0.05),IL-1β+TSC组明显高于IL-1β组(P<0.05);Bax、Caspase-3、Caspase-9 m RNA表达,IL-1β组明显高于空白组(P<0.05),IL-1β+TSC组明显低于IL-1β组(P<0.05)。(5)各组第3代软骨细胞干预72小时后p-ERK-1、p-ERK-2、p-P38蛋白表达:IL-1β组明显均高于空白组(P<0.05),IL-1β+TSC组明显低于IL-1β组(P<0.05)结论:1、体内外研究表明,上游IL-1β/MAPKs信号通路的高度活化,下游Caspase-3、Caspase-9的高表达,促凋亡因子Bax的高表达、抗凋亡因子Bcl-2的低表达,是OA的发生发展、软骨细胞凋亡的可能机制之一。2、体内外研究表明,TSC可以延缓软骨组织退变,抑制软骨细胞凋亡,并对其上游IL-1β/MAPKs通路,下游Caspase-3、Caspase-9表达及凋亡调控因子Bcl-2、bax的表达进行有效调控,这可能是TSC防治OA、抑制软骨细胞凋亡的机制之一,TSC的调控效果与TSC浓度有一定的关系。3、体内研究表明,高剂量TSC在抑制IL-1β/MAPKs信号通路的激活、上调Bcl-2的表达及下调Caspase-3的表达方面优于塞来昔布,而在下调Bax及Caspase-9表达方面与塞来昔布相当。