牡丹初始外植体褐变机理及影响因素的研究

在牡丹组织培养初代过程中，外植体易发生褐变，导致培养物生理功能衰退，严重阻碍了牡丹组织培养的正常进行。本文对牡丹初始外植体褐变相关的各项生理因子及影响因素进行了系统研究。目的在于了解褐变发生机理，从理论上认识外植体组织褐变；通过研究各因素对褐变的影响，找到影响褐变的主导因子，以期为牡丹初始外植体克服褐变提供理论依据和技术支持。 对褐变机理的研究，分别统计和测定初代培养期间褐变指数、总酚含量，PPO活性、SOD活性、POD活性、 CAT活性、 MDA含量及相对电导率，研究初代培养过程中这些指标变化与外植体褐变的关系，结果表明：初代培养褐变过程中，‘胡红’、‘凤丹’外植体褐变指数和褐变度均明显升高；总酚含量在褐变的组织材料中变化剧烈，且含量始终保持较高水平；PPO活性、POD活性变化趋势相同均呈先升高然后下降的趋势；SOD活性虽然在初期略有升高但升幅不大，随后明显下降；CAT活性则从初期就表现了明显的下降趋势。MDA含量和细胞膜相对透性在培养过程中均显著增加。 通过对PPO活性、总酚含量及褐变的相关分析发现：总酚含量与褐变存在显著的相关关系，总酚含量的高低是褐变发生的关键因素。总酚含量较高的胡红较酚含量较低的凤丹更容易发生褐变。由于PPO酶活性增加、总酚含量上升与外植体褐变指数升高呈正相关，在培养后期酶活性与总酚含量下降与褐变指数的迅速增加呈显著负相关。因此可以推论在外植体组织褐变的过程中存在两个阶段，一是启动褐变阶段，另一是褐变加剧的阶段。 对酶系统与褐变的相关分析表明：褐变指数的增加与细胞膜透性上升呈显著负相关，MDA含量增加与膜透性上升呈显著正相关，SOD活性变化与膜透性上升呈显著负相关，MDA含量的增加与SOD活性下降呈负相 关，这些都说明了牡丹外植体初代培养过程中膜脂过氧化加剧导致膜透性增加，细胞中酚-酶的区域化分布被打破，进而导致酚类物质的酶促氧化。因此实验认为膜透性增加是导致后期外植体褐变加剧的主要原因。 本实验通过对外植体不同生理状态、基因型，不同培养基，不同消毒处理方法，不同预处理，不同培养条件以及不同抗氧化剂及吸附剂对褐变的影响，研究了各个因素对褐变程度的影响，结果表明：取材季节和部位是影响牡丹初代离体培养外植体褐化的主要因素。4月中旬，花期前一个周取材褐化率最低。下部腋生枝条顶芽作外植体比其他部位取材褐变率低。低温处理对减缓褐变有一定的影响，但会降低外植体生活能力。强光培养由于强光刺激了多酚氧化酶活性提高，则在培养过程中更容易发生褐变。此外实验证实高的无机盐浓度及分裂素浓度均可加剧外植体褐变。而常规防褐剂硫代硫酸钠、VC、AC、PVP对牡丹外植体褐变效果影响不大