肝素对人增生性瘢痕成纤维细胞及兔耳增生性瘢痕影响的实验研究

研究背景瘢痕是烧伤整形外科的常见病，其发生机理比较复杂，目前尚无突破性进展。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是常见的病理性瘢痕，目前尚无特效的治疗方法。增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的治疗也非常棘手。目前研究证明，瘢痕是组织损伤后常见的并发症，组织损伤创面愈合是一个非常复杂的过程，它包括细胞的增殖和细胞外基质的合成等方面，胶原蛋白、bFGF和TGFβ1等均参与了组织损伤后发生的炎症反应过程，并与瘢痕形成关系密切。生长因子是一组在创面愈合中发挥重要作用的蛋白，是目前研究的热点内容之一。有资料表明肝素不但可以影响成纤维细胞的增殖和胶原的产生，作为一种创面愈合的调节因子，它还可以通过改变bFGF和TGFβ1来调节成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的表达，可能是一种抑制组织纤维化，治疗瘢痕增生的新药物。 目的：研究不同浓度肝素对人的正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞的bFGF，TGFβ1和bFGF mRNA，TGFβ1mRNA的表达的作用，对于兔耳增生性瘢痕的胶原蛋白，bFGF和TGFβ1的表达的影响，从而阐明肝素对增生性瘢痕的作用，为临床上应用肝素治疗瘢痕增生提供新的方法。 方法：用组织块法将人的正常皮肤和增生性瘢痕组织进行体外培养，取3—4代培养的正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞分为4组，分别置于含0μg／ml（A组），100μg／ml（B组），300μg／ml（C组）和600μg／ml（D组）浓度的肝素的无血清培养基中培养，收集细胞，通过ELISA和RT-PCR的方法分别检测用药后24，48，72和96小时的两种细胞bFGF，TGFβ1和bFGFmRNA和TGFβ1mRNA表达的水平。 选择健康成年新西兰大白兔48只，3％戊巴比妥钠（1.5mg／kg）腹腔麻醉后，在兔耳腹侧面制作创面，构建兔耳增生性瘢痕模型。术后第21天，待增生性瘢痕形成后，随机分为A，B，C，D四组，每一组12只。A组为对照组，不用药，B，C，D三组为实验组分别按照100u／kg，200u／kg，400u／kg剂量静脉滴注，每日两次，连用7天。在停药后1天、3天、7天、14天、21天、30天和40天取材，一份放于10％中性福尔马林固定，另一份置于-80度冰箱保存。取材后，固定，切片，计算瘢痕增生指数。做免疫组化染色，观察collagenⅠ（Ⅰ型胶原），collagenⅢ（Ⅲ型胶原），用计算机图像分析后，计算表达指数（expression index，EI）和Ⅰ／Ⅲcollagen比值；比较实验组和对照组之间及在不同时相点collagenⅠ、collagenⅢ、Ⅰ／Ⅲcollagen比值的表达水平的不同及变化规律。通过ELISA的方法分别检测用药后1天、3天、7天、14天、21天、30天和40天兔耳增生性瘢痕中的bFGF和TGFβ1表达水平。测定结果以（?）±S表示，数据应用Microsoft Excel软件处理，作组间、组内t检验，P＜0.05即定位差异有显著性意义。 结果：不同浓度梯度的肝素作用于人成纤维细胞后与空白对照A组相比较，在24h，48h，72h和96h各个时间点，B组，C组和D组均可刺激正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞在所有时间点产生高表达bFGF，范围分别是393％—1019％、405％—899％；bFBFmRNA水平上调，范围分别是251％—683％和412％—799％，其差异具有统计学意义（P＜0.01），所有组的bFGF和bFGFmRNA测量值均在24h达到高峰，以后逐渐下降，48h时达到一平台期的水平维持到96h．。和空白对照A组相比较，C组和D组肝素能够刺激上调正常皮肤成纤维细胞(TGFβ1和TGFβ1mRNA表达，TGFβ1及TGFβ1mRNA表达，范围分别是26％—83％和51％—68％，在72h的时间点，D组的TGF-61和TGFβ1mRNA测量值，远高于C组，二者差异具有统计学意义（P＜0.05）。在增生性瘢痕成纤维细胞的无血清培养基中加入不同浓度肝素同样上调了TGF-β1和TGFβ1mRNA的水平，与空白对照组A组相比较，只有D组（600μg／ml）的TGF-β1和TGFβ1mRNA在24，48，72和96h分别增加了85％，77％，63％，83％和52％，44％，33％，51％，在各个时间点与空白对照组比较，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。 在兔耳增生性瘢痕动物实验中，实验组B（100u／kg），C（200u／kg），D（400u／kg）组和对照组A组兔耳增生性瘢痕增生指数比较，1-7天内增生指数没有差别（P＞0.05），A组（对照组）增生指数持续增高第14天时达峰值。实验组（B，C，D组）在用药后第7天达到高峰，此后逐渐下降达平台期。用药后第14，21，30，40天，实验组（B，C，D组）与对照组（A组）比较增生指数降低，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。应用免疫组化方法对兔耳增生性瘢痕组织中Ⅰ型Ⅲ型胶原表达指数（EI）检测，ABCD四组EI值均在第1-14天逐渐上升，第14天达顶峰，此后逐渐下降达平台期，其中Ⅰ型胶原用药后第14，21，30，40天C、D组表达指数低于A、B组，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。Ⅲ型胶原EI值1-40天内各时间点C、D组明显小于A、B组，其差异具有统计学意义（P＜0.01）。计算Ⅰ／Ⅲ型胶原比值，所有时间点C，D组均大于A、B组，其差异具有统计学意义（P＜0.01），而且在第21天后Ⅰ／Ⅲ型胶原比值明显上升达到一平台值。B组与A组比较，Ⅰ／Ⅲ型胶原比值在用药后的第1，3，30，40天4个时间点增高，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。 兔耳增生性瘢痕组织样本用ELISA检测，实验组（B、C，、D组）和对照组（A组）相比较，在所有时间点，B组（153％-294％）C组（210％-372％）D组（208％-374％）均表现出肝素可以刺激增生性瘢痕组织产生高表达bFGF，与对照组差异均具有统计学意义（P＜0.05）；所有的样本bFGF含量均在24h达高峰，以后逐渐下降，第21天时达到一平台期的水平。和A组（对照组）比较，C组（200u／kg）和D组（400u／kg）的样本在用药后的1、3、7天TGFβ1分别增加了95％，93％，52％和96％，94％，73％，且大于B组增加值32％，30％，17％，其差异具有统计学意义（P＜0.05）。A，B，C，D四组的TGFβ1表达水平在第14，21，30，40天四个时间点的表达差异无统计学意义（P＞0.05）．。B、C、D三组所有的样品的TGFβ1含量均在24h达高峰，以后逐渐下降，到第21天时达到一平台期的水平。 结论：肝素能够促进人正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞bFGF和bFGFmRNA表达水平明显升高，轻度上调TGFβ1及TGFβ1mRNA的表达水平。肝素能够降低兔耳增生性瘢痕增生指数，降低兔耳增生性瘢痕组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原表达指数，Ⅰ／Ⅲ型胶原比值升高；刺激兔耳增生性瘢痕组织中bFGF表达明显增多，轻度上调TGF-β1的表达水平，预示着肝素可能是一种潜在的防治瘢痕增生的药物。