杜仲提取物5-羟甲基-2-糠醛诱导细胞成脂分化的信号途径研究

目的： 观察从杜仲中提取的有效单体物质 5-羟甲基-2-糠醛(5-hydroxymethyl-2-furaldehyde,5-HMF),作为从大鼠中分离培养的脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived stromal cells, AD-MSCs)的诱导剂,使其向脂肪细胞分化,以及这个过程中的相关信号途径变化,进一步来探讨传统中药杜仲防治骨质疏松症的作用和机制。方法1.体外分离培养纯化大鼠ADSCs;2.通过盐制杜仲的水煮、浓缩、萃取、沉淀,以及HPLC等方法,制备5-HMF；3.运用传统激素诱导法,使培养的大鼠ADSCs向脂肪细胞方向诱导分化。观察方法：应用油红0染色来显示诱导细胞脂滴的形成情况,以脂滴作为观察指标来确定诱导细胞的分化程度。4.5-HMF对ADSCs成脂分化的影响。将已经纯化培养的大鼠ADSCs分组为5-HMF实验组,向脂肪细胞分化诱导阳性对照组,阴性对照组,诱导大鼠ADSCs向脂肪细胞分化。细胞经过诱导后,利用倒置显微镜对诱导细胞进行形态学观察和拍摄照片。5.5-HMF抑制ADSCs成脂分化的信号途径变化研究。将已经纯化培养的ADSCs分组为成脂分化阳性对照组、阴性对照组、5-HMF+成脂分化阳性对照组,细胞经过诱导两个星期后,提取诱导细胞总RNA,逆转录,利用实时荧光定量PCR方法检测各红Fzd3、MEK1/2、ERK1/2、Raf、b-Catenin、和c-myc mRNA的表达的变化；利用蛋白免疫印迹方法提取蛋白质,检测：P38、p-P38、b-Catenin、p-b-Catenin、 ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的变化。加入Wnt信号通路抑制剂DKK1和MAPK信号通路抑制剂U0126,到含5-HMF诱导成脂分化的ADSCs中,实时荧光定量PCR法检测PPARg、Adipoq和FABP4 mRNA的表达的变化；运用蛋白免疫印迹方法来检测p-PPARg、FABP4和PPARg蛋白表达的变化。结果1.加入5-HMF到ADSCs的成脂分化过程中,脂滴形成的数量显著减少,脂肪细胞标志蛋白,比如PPARg、Adipoq和FABP4等的表达都明显降低。2.脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中,Wnt信号通路和MAPK信号通路被激活或抑制。两种信号通路的抑制剂可以削弱5-HMF抑制ADSCs向脂肪细胞分化的作用。结论杜仲有效单体提取物质5-HMF对大鼠脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化具有明显的抑制作用；这种抑制作用与Wnt信号通路和MAPK信号通路途径的变化有密切的联系。