目的:以乌梅丸方证研究为理论基础,观察乌梅丸及其拆方对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜组织病理学变化、炎性细胞因子及TLR9/My D88/NF-κBp65和IL-6/JAK/STAT3信号通路的影响,分析溃疡性结肠炎发病的免疫学机制,探讨乌梅丸治疗溃疡性结肠炎的作用靶点,揭示乌梅丸酸苦调肝、辛苦和脾胃的配伍意义。材料与方法:整理相关古籍文献,解析乌梅丸方药配伍规律及特点,奠定乌梅丸拆方实验的理论基础。动物实验将SPF级健康成年Wistar大鼠应用2,4,6-三硝基苯磺酸/乙醇法制备溃疡性结肠炎模型。大鼠随机分为正常组、模型组、柳氮磺吡啶组、乌梅丸组、乌梅辛开苦降组(乌梅+辛味药+苦味药)、乌梅辛开组(乌梅+辛味药)、乌梅苦降组(乌梅+苦味药)、乌梅补益组(乌梅+甘味药)。各组大鼠给予相应的治疗药物灌胃,周期为28d。然后腹腔注射10%水合氯醛麻醉处死各组大鼠并取材。观测大鼠疾病活动指数(DAI)及结肠黏膜损伤程度;显微镜下观察结肠黏膜组织病理切片;检测结肠粘膜组织SOD与MDA水平;ELISA法检测血清白介素-10(IL-10)、肿瘤细胞坏死因子-α(TNF-α)和结肠黏膜组织白介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)水平;免疫组化法观察Toll样受体9(TLR9)、髓样分化因子88(My D88)、细胞核因子κBp65(NF-κBp65)的表达;RT-PCR法检测结肠黏膜组织IL-6、酪氨酸激酶(JAK)、核转录因子信号和转录激活子3(STAT3)m RNA表达。所有实验数据均使用SPSS18.0统计软件分析结果,组间比较应用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1一般状态及DAI、肠黏膜损伤程度评分造模后第二天大鼠明显出现便溏、便血及肛周污秽,其后并逐渐出现饮食量减少、毛发不洁而无光泽、畏寒蜷卧、懒动、消瘦等表现。经灌胃给药治疗后,柳氮磺吡啶组、乌梅丸组和乌梅辛开苦降组大鼠均有程度不同的症状改善,三组DAI及结肠黏膜损伤程度评分均显著低于模型组及乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组(P<0.01),而乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。2结肠黏膜组织病理学变化模型组大鼠结肠黏膜缺失明显,固有层内腺体破损或消失,杯状细胞减少,并有大量炎性细胞浸润;柳氮磺吡啶组、乌梅丸组大鼠结肠黏膜周围上皮增生修复,上皮细胞缺损不明显,杯状细胞丰富,其基本形态与正常组相似;乌梅辛开苦降组大鼠结肠黏膜缺损较表浅,腺体增生活跃,黏膜固有层可见少量炎性细胞浸润;乌梅辛开组、乌梅苦降组、乌梅补益组大鼠镜下结构相似,结肠黏膜仍有部分缺损,腺体结构不完整,杯状细胞明显减少,黏膜固有层仍有较大量炎性细胞浸润。3结肠黏膜组织SOD与MDA水平与正常组大鼠比较,模型组大鼠结肠黏膜SOD水平明显下调、MDA水平显著上调(P<0.01)。与模型组大鼠比较,各治疗组大鼠结肠黏膜SOD水平均明显上调、MDA水平均明显下调(P<0.01)。乌梅丸组和乌梅辛开苦降组与柳氮磺吡啶组对比,大鼠结肠黏膜SOD及MDA水平均没有统计学差异(P>0.05),但此三组大鼠结肠黏膜组织SOD水平均明显高于乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组,而MDA水平均明显低于乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组(P<0.01)。4血清IL-10、TNF-α及结肠黏膜组织IL-4、IL-6、IFN-γ的检测4.1血清IL-10、TNF-α水平与正常组大鼠比较,模型组大鼠血清IL-10水平明显下调(P<0.01)。与模型组大鼠对比,柳氮磺吡啶组、乌梅丸组、乌梅辛开苦降组以及乌梅补益组大鼠血清IL-10水平明显上调(P<0.01),而乌梅辛开组和乌梅苦降组无统计学差异(P>0.05)。柳氮磺吡啶组大鼠血清IL-10水平显著高于其它各治疗组(P<0.01)。乌梅丸组大鼠血清IL-10水平显著高于乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组(P<0.01)。乌梅辛开苦降组大鼠血清IL-10水平与乌梅丸组及乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组比较均无统计学差异(P>0.05)。与正常组大鼠比较,模型组大鼠血清TNF-α水平显著升高(P<0.01)。与模型组大鼠比较,各治疗组大鼠血清TNF-α水平均明显降低(P<0.01)。乌梅丸组大鼠血清TNF-α水平与柳氮磺吡啶组比较无统计学差异(P>0.05)。乌梅丸组大鼠血清TNF-α水平显著低于乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组(P<0.01)。乌梅辛开苦降组大鼠血清TNF-α水平与乌梅丸组及乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组比较均无统计学差异(P>0.05)。4.2结肠黏膜组织IFN-γ、IL-4、IL-6水平与正常组大鼠比较,模型组大鼠结肠黏膜组织IFN-γ水平显著升高(P<0.01)。与模型组大鼠比较,除乌梅补益组外,其它各治疗组大鼠结肠黏膜组织IFN-γ水平均显著降低(P<0.01)。与柳氮磺吡啶组比较,乌梅丸组大鼠结肠黏膜组织IFN-γ水平无统计学差异(P>0.05),而其它各乌梅丸拆方组均显著增高(P<0.01)。与乌梅丸组比较,乌梅辛开苦降组、乌梅辛开组及乌梅苦降组均无统计学差异(P>0.05),而乌梅补益组大鼠结肠黏膜组织IFN-γ水平显著增高。与乌梅辛开苦降组比较,乌梅辛开组、乌梅苦降组大鼠结肠黏膜组织IFN-γ水平均无统计学差异(P>0.05),而乌梅补益组大鼠结肠黏膜组织IFN-γ水平显著增高(P<0.01)。与正常组大鼠比较,模型组大鼠结肠黏膜组织IL-4水平显著降低(P<0.01)。与模型组大鼠比较,各治疗组大鼠结肠黏膜组织IL-4水平均显著升高(P<0.01)。与柳氮磺吡啶组比较,乌梅丸组及其各拆方组大鼠结肠黏膜组织IL-4水平均显著降低(P<0.01)。与乌梅丸组比较,乌梅辛开苦降组大鼠结肠黏膜组织IL-4水平无统计学差异(P>0.05),而乌梅辛开组、乌梅苦降组及乌梅补益组结肠黏膜组织IL-4水平均显著降低(P<0.01)。与乌梅辛开苦降组比较,乌梅辛开组、乌梅苦降组及乌梅补益组结肠黏膜组织IL-4水平均显著降低(P<0.01)。与正常组大鼠比较,模型组大鼠结肠黏膜组织IL-6水平显著升高(P<0.01)。与模型组大鼠比较,各治疗组结肠黏膜组织IL-6水平均显著降低(P<0.01)。与柳氮磺吡啶组比较,乌梅丸组及其各拆方组结肠黏膜组织IL-6水平均显著增高(P<0.01)。与乌梅丸组比较,乌梅辛开苦降组、乌梅辛开组、乌梅苦降组(P<0.01)及乌梅补益组(P<0.05)结肠黏膜组织IL-6水平均显著增高。与乌梅辛开苦降组比较,乌梅辛开组、乌梅补益组结肠黏膜组织IL-6水平无统计学差异(P>0.05),而乌梅苦降组结肠黏膜组织IL-6水平显著增高(P<0.01)。5结肠黏膜组织TLR9、My D88、NF-κBp65表达5.1结肠黏膜组织TLR9的表达与正常组大鼠比较,模型组大鼠结肠黏膜组织TLR9的表达显著上调(P<0.01),与模型组大鼠比较,各治疗组大鼠结肠黏膜组织TLR9的表达均显著下调(P<0.01)。与柳氮磺吡啶组比较,乌梅丸组大鼠结肠黏膜组织TLR9表达无显著性差异(P>0.05),而其它各拆方组大鼠结肠黏膜组织TLR9表达均高于柳氮磺吡啶组,有显著性差异(P<0.01)。与乌梅丸组大鼠比较,乌梅辛开苦降组大鼠结肠黏膜组织TLR9的表达无显著性差异(P>0.05),且二组TLR9的表达均显著低于其它各拆方组(P<0.01)。5.2结肠黏膜组织MyD88的表达与正常组大鼠比较,模型组大鼠结肠黏膜组织My D88的表达显著上调(P<0.01),与模型组大鼠比较,各治疗组大鼠结肠黏膜组织My D88的表达均显著下调(P<0.01)。与柳氮磺吡啶组比较,乌梅丸组大鼠结肠黏膜组织My D88表达无显著性差异(P>0.05),而其它各拆方组大鼠结肠黏膜组织My D88表达均高于柳氮磺吡啶组,有显著性差异(P<0.01)。与乌梅丸组大鼠比较,乌梅辛开苦降组大鼠结肠黏膜组织My D88的表达无显著性差异(P>0.05),且二组My D88的表达均显著低于其它各拆方组(P<0.01)。5.3结肠黏膜组织NF-κBp65的表达与正常组大鼠比较,模型组大鼠结肠黏膜组织NF-κBp65的表达显著上调(P<0.01)。与模型组大鼠比较,柳氮磺吡啶组、乌梅丸组、乌梅辛开苦降组、乌梅补益组大鼠结肠黏膜组织NF-κBp65的表达均显著下调(P<0.01),而乌梅辛开组、乌梅苦降组与模型组比较均无显著性差异(P>0.05)。与柳氮磺吡啶组比较,乌梅丸组大鼠结肠黏膜组织NF-κBp65表达无显著性差异(P>0.05),而其它各拆方组大鼠结肠黏膜组织NF-κBp65表达均高于柳氮磺吡啶组,有显著性差异(P<0.01)。与乌梅丸组大鼠比较,乌梅辛开苦降组大鼠结肠黏膜组织NF-κBp65的表达无显著性差异(P>0.05),且二组大鼠结肠黏膜组织NF-κBp65的表达均显著低于其它各拆方组(P<0.01)。6结肠黏膜组织IL-6、JAK、STAT3 m RNA表达水平6.1结肠黏膜组织IL-6 m RNA相对表达量与正常组大鼠比较,模型组IL-6 m RNA相对表达量显著升高(P<0.01)。与模型组大鼠比较,柳氮磺吡啶组、乌梅丸组和乌梅辛开苦降组IL-6 m RNA相对表达量显著降低(P<0.01),而乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组IL-6 m RNA相对表达量与其没有显著差异(P>0.05)。柳氮磺吡啶组和乌梅丸组IL-6 m RNA相对表达量比较没有显著差异(P>0.05),且两组IL-6 m RNA相对表达量均显著低于乌梅辛开苦降组(P<0.01)。但三组IL-6 m RNA相对表达量均显著低于乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组(P<0.01)。6.2结肠黏膜组织Jak mRNA相对表达量与正常组大鼠比较,模型组Jak m RNA相对表达量显著升高(P<0.01)。与模型组大鼠比较,柳氮磺吡啶组、乌梅丸组和乌梅辛开苦降组Jak m RNA相对表达量均显著降低(P<0.01),而乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组Jak m RNA相对表达量与其没有显著差异(P>0.05)。柳氮磺吡啶组、乌梅丸组、乌梅辛开苦降组Jak m RNA相对表达量比较没有显著差异(P>0.05)。但三组Jak m RNA相对表达量均显著低于乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组(P<0.01)。6.3结肠黏膜组织STAT3 m RNA相对表达量与正常组大鼠比较,模型组STAT3 m RNA相对表达量显著升高(P<0.01)。与模型组大鼠比较,各治疗组STAT3 m RNA相对表达量显著降低(P<0.01)。柳氮磺吡啶组、乌梅丸组、乌梅辛开苦降组STAT3 m RNA相对表达量比较没有显著差异(P>0.05)。但三组STAT3 m RNA相对表达量均显著低于乌梅辛开组、乌梅苦降组和乌梅补益组(P<0.01)。结论:1乌梅丸方证理论研究表明乌梅丸治疗蛔厥、久利及伤寒厥阴病证的药物配伍机制,重点在于酸苦柔肝泄肝、辛苦和调脾胃。酸苦、辛苦相合法可能是乌梅丸组方的根本形式。2成功构建了2,4,6-三硝基苯磺酸/乙醇法诱导的溃疡性结肠炎大鼠模型。3溃疡性结肠炎模型大鼠肠道炎症的发生与结肠黏膜异常的脂质过氧化反应、促炎与抑炎免疫失衡及TLR9/My D88/NF-κBp65与IL-6/JAK/STAT3两信号传导通路的异常激活存在密切的联系,且两信号通路可能发挥了重要的协同作用。4乌梅辛开苦降组药物对上述免疫失调指标的整体调节和修复效果显著优于其它各拆方组药物。5乌梅丸治疗溃疡性结肠炎的作用机制可能在于其对上述免疫失调指标的整体调节和修复,而乌梅丸治疗功用的实现可能根源于其酸苦与辛苦药味相合的配伍特点。
