内毒素血症大鼠心肌损伤作用机制研究及诱导多能干细胞系的建立

研究背景和目的内毒素血症是由革兰阴性菌细胞壁主要成分内毒素引起的,可诱发内毒素性休克,导致多器官损害及功能衰竭。心脏是内毒素血症时最常受累器官之一,心肌损伤是内毒素血症重要临床表现,是导致ICU患者死亡的主要原因,但是其确切机制目前并不十分清楚。microRNA(miRNA, miR)是一类广泛存在于真核生物中,长约21-25个核苷酸的内源性非编码单链小RNA,具有促进mRNA降解或抑制其转录发挥蛋白水平的调节功能,在心肌肥大、心肌梗死和心肌纤维化等心脏疾病中起着重要作用,因而被认为是心脏功能的关键调节者和预防、诊断、治疗心脏疾病的潜在生物分子。研究miRNA在心脏疾病中作用机制,对于阐明心脏疾病发病的分子机制,指导开发miRNA靶标治疗相关心脏疾病的新药物,为心脏疾病提供新的诊断和预后标志物,提供新的思路与方法和开辟新的道路,具有重要的意义和应用价值。本研究以内毒素血症致心肌损伤大鼠为研究对象,应用多种分子生物技术和生物信息学的方法,从基因学水平分析心肌组织miRNA差异表达谱的变化,验证和预测miRNA可能调控的靶基因,旨在揭示miRNA在内毒素血症心肌损伤中可能的作用机制和发现对其防治具有干预作用的新的靶分子提供实验依据。目前,大部分疾病的发病作用机制研究是在动物模型上完成的,然而人类的遗传特性与动物之间存在很大的差异,使用动物模型来研究人类疾病,难以完全揭示人类疾病真实本质。因而,寻找新的有效的研究方法和技术,发展和建立体外人类疾病研究模型,可为研究阐明其发生的病理生理学作用机制和研发治疗药物及其作用靶标提供重要的研究工具,对开展疾病发病的基础和临床医学研究具有重要的应用意义和价值。诱导多功能干细胞(Induced pluripotent stem cells, IPSCs)是指一种利用特定的转录因子将体细胞重编程而获得的类似于胚胎干细胞(embryonic stem cells、 ESC)的多分化潜能的干细胞。它具有ESC细胞相似的自我更新能力及分化为各种器官的潜在能力；且因为其遗传物质与患者的一致,不会出现免疫排斥反应,没有伦理学阻碍,又拥有细胞来源丰富等特点；这些优势使其已经广泛应用于细胞移植治疗,器官再生,构建疾病细胞模型,建立疾病特异性多功能干细胞以及疾病发生机制、新的治疗方法、新药筛选和药物毒理等方面的研究。目前,研究报道多种疾病特异性诱导性多能干细胞系已获成功建立,但纵观国内外,尚未见到利用内毒素血症肺损伤患者体细胞成功诱导出多能干细胞的报道。我们在体外利用Sox2、Oct4、Nanog、Klf4基因将内毒素血症肺损伤病人的皮肤成纤维细胞重新编程为IPSCs,并建立和发展内毒素血症肺损伤病人特异性的干细胞系,旨在为内毒素血症肺损伤发病机制和治疗药物筛选的基础研究以及细胞移植治疗实验研究提供良好的细胞模型和更理想的细胞来源。1.雄性SD大鼠随机分为2组：LPS组(n=10)大鼠腹腔注射LPS 10mg/kg;对照组(n=10)大鼠腹腔注射等量生理盐水。注射24h后颈锥脱臼处死大鼠,取出心肌组织。Real-time PCR检测心肌组织TNF-α、TLR4和IL-1β的表达水平；光、电镜观察心肌组织细胞形态和超微结构的变化；miRNA表达谱芯片分析大鼠心肌组织中差异表达的miRNA; Real-time PCR验证各候选miRNA的表达水平；生物信息学预测miRNA靶基因；双荧光素酶报告基因检测系统对miRNA靶基因进行验证。2.选取内毒素血症肺损伤病人的皮肤组织,体外培养获得病人皮肤成纤维细胞,采用慢病毒介导逆转录的方法,将含有Sox2、Oct4、Nanog和Klf4四个因子的混合慢病毒转染至内毒素血症肺损伤患者皮肤成纤维细胞,诱导出胚胎干细胞样克隆。再通过碱性磷酸酶染色(alkaline phosphatase staining)、实时荧光定量PCR (RT-PCR)、免疫荧光染色(immunofluorescent staining)和体内畸胎瘤形成实验技术和方法,根据人胚胎干细胞的特性,对获得的病人皮肤成纤维细胞源性IPSC进行鉴定。研究结果1. 内毒素血症大鼠心肌组织中TNF-α、TLR4和几-1β的表达水平升高,且心肌组织细胞形态和超微结构发生损伤性变化。2.内毒素血症大鼠心肌组织差异表达显著的miRNA:上调最明显的10个miRNA包括miR-21-3p, miR-194-3p, miR-344a-3p, miR-465-3p, miR-3596c, miR-501-5p, miR-185-3, miR-877p, miR-186-3p和miR-3592；下调最明显的10个miRNA包括miR-208b-3p, miR-141-3p, miR-547-3p, miR-28-5p, miR-199a-5p, miR-335, miR-322-5p, miR-532-5p, miR-3585-5p和miR-339-3p。3.在筛选出的20个候选miRNA中,提示有12个miRNA(包括7个上调1niRNA和5个下调1niRNA)可能与内毒素血症大鼠心肌细胞损伤和线粒体结构破坏相关。4.在这些miRNA中,miR-194在内毒素血症大鼠心肌组织中表达显著上调,而miR-141显著下调。5. miR-194表达上调的H9C2细胞株中Fmrl和Sumo2的表达显著降低,证明miR-194可以在转录水平抑制Fmrl和Sumo2基因的表达。6. miR-141表达下调的H9C2细胞株中Myh10和Cyp26b1的表达显著升高,证明miR-141可以在转录水平抑制Myh10和Cyp26b1基因的表达。7.原代培养人皮肤成纤维细胞并重编程为IPSCs,获得的ES样细胞克隆AP染色呈阳性。8.细胞免疫荧光染色证实IPSCs表达人胚胎干细胞(hES)多能性基因标记NANOG、SSEA3和Tra-1-81。9. Real-time PCR结果表明IPSCs高表达内源多能基因Sox2、Oct4、Nanog和Klf4,与hES细胞基因表达谱相类似。10.经过体内实验分化形成的畸胎瘤组织可观察到有三胚层结构。结论1.内毒素血症大鼠心肌组织中TNF-α、TLR4和几-1β的表达水平升高,且心肌组织细胞形态学和超微结构发生损伤变化以及线粒体结构破坏,表明内毒素血症心肌组织损伤大鼠模型成功建立。2.内毒素血症大鼠心肌组织miRNA表达差异显著,其中miR-194表达显著上调和miR-141表达显著下调为首次发现,可能在内毒素血症大鼠心肌损伤作用机制中起着重要作用,有可能是内毒素血症心肌损伤治疗干预作用的新的潜在靶分子。3.以慢病毒作为Sox2、Oct4、Nanog和Klf4四个逆转录因子的转移载体,能将内毒素血症肺损伤病人的皮肤成纤维细胞重新编程为诱导性多能干细胞。4.重新编程的IPSCs在基因表达、表面抗原、克隆形态和碱性磷酸酶活性等方面都跟人ES细胞高度相似。5.将IPSCs移植至免疫缺陷大鼠体内可以形成有三胚层结构的畸胎瘤。6.首次成功建立内毒素血症肺损伤病人IPSCs,提示可为阐明肺损伤发病机制、临床药物筛选和有关细胞移植的实验研究提供良好的细胞模型和更理想的细胞来源。