目的:研究玉米幼芽提取物(Extracts of Maize Plumule, EMP)对皮肤细胞生长发育、对氧化损伤的真皮肤细胞结构和蛋白表达的影响。评价EMP抗皮肤氧化损伤和抗衰老的效果并探讨其相关机制,初步探讨EMP对间充质干细胞生长的影响。
方法:(1)原代分离获得生长稳定的小鼠皮肤成纤维细胞,通过形态观察、MTT和结构相关蛋白基因表达测定,分析EMP对其生长的影响。(2)小鼠皮肤成纤维细胞预先用EMP保护后,复制小鼠皮肤成纤维细胞体外H2O2氧化损伤模型,通过H.E染色、扫描电镜、透射电镜、Hoechst凋亡率检测、NADPH分布等手段,观察EMP对小鼠皮肤成纤维细胞的抗氧化作用;通过细胞微丝、微管的间接免疫荧光检测,观察抗氧化损伤过程中EMP对细胞骨架的影响;同时通过半定量RT-PCR法检测氧化损伤后细胞内β-Actin、Tubulin-α、I型前胶原、III型前胶原基因的表达量,从而全面分析EMP对小鼠皮肤成纤维细胞体外抗氧化作用的影响。(3)对小鼠局部皮肤脱毛后,用EMP进行保护,并对局部皮肤组织用30%的H2O2持续涂抹进行损伤,通过大体观察、病理切片和透射电镜等手段观察其病理学变化,同时检测局部皮肤组织中SOD、CAT、GSH-PX活性和MDA、羟脯氨酸含量,从而分析EMP对小鼠局部皮肤氧化损伤的影响。(4)通过给幼龄家蚕服用EMP,观察其生长和抗逆能力等相关各项生命指标,分析其抗衰老机制;并通过复制5龄家蚕局部氧化损伤模型,通过对其生长、抗逆能力、血淋巴中抗氧化酶活性和局部损伤皮肤中微管蛋白、家蚕胶原蛋白基因表达量的变化进行检测,从而分析EMP对局部皮肤氧化损伤所引起的全身抗氧化应答的影响。(5)分离获得小鼠骨髓间充质干细胞,并在培养体系中添加EMP,通过观察其生长情况、细胞周期和胶原相关基因表达情况,从而初步探索EMP对间充质干细胞生长的影响。
结果:(1)在小鼠皮肤成纤维细胞培养体系中添加20 mg/L EMP经过120 h后,MTT的OD值达到1.097±0.021,显著高于其它各组(0.360±0.010～1.023±0.031)(p<0.01);其96h单视野细胞数为279.333±15.308个,显著高于对照组的133.000±32.527个(p<0.01)。(2)在细胞体外氧化损伤过程中,EMP保护组细胞骨架和亚细胞结构与损伤对照组相比更加完整,细胞凋亡率为(38.38±3.544)%,显著低于损伤对照组的(70.98±3.045)%(p<0.01);EMP保护组Tubulin-α、I型前胶原、III型前胶原基因表达产物相对灰度值分别为0.811±0.067、0.659±0.026和0.549±0.078均显著高于损伤对照组的0.628±0.055、0.237±0.035和0.217±0.040(p<0.05)。(3)在皮肤组织的体内氧化损伤过程中,EMP保护组和EMP+Vc保护组与损伤对照组相比皮肤组织结构更加完整,皮肤组织各层结构连接紧密,试验各组SOD、CAT、GSH-PX活性均显著高于损伤对照组(p<0.05或p<0.01),其中EMP保护组和EMP+Vc保护组GSH-PX活性分别为116.793±5.544和117.187±4.482,均显著高于损伤对照组的44.515±4.629(p<0.01);此外EMP保护组和EMP+Vc保护组羟脯氨酸含量分别为23.848±2.721和26.970±1.571,均高于损伤对照组的6.827±1.901(p<0.01);而MDA含量分别为10.108±1.836和7.258±1.002均显著低于损伤对照组的11.866±1.666(p<0.01)。(4)在EMP对家蚕抗衰老作用的研究中,用20mg/kg和40 mg/kg EMP饲喂家蚕时,家蚕幼虫寿命(617.793±2.4506 h和23.793±1.378 h)与对照组(613.997±4.289 h)相比分别延长了约4h和10h(p<0.01),此外其幼虫的抗逆能力与对照组相比也有所提高;在家蚕皮肤氧化损伤模型中,EMP各保护组幼虫体重均显著高于损伤对照组,20mg/kg EMP保护组家蚕血中SOD、CAT活性分别为1656.908±108.461和26.404±0.068,均显著高于损伤对照组的1411.539±79.444和17.268±0.136(p<0.01);此外EMP保护组家蚕皮肤细胞胶原的基因表达量也显著高于损伤对照组。(5)在EMP对间充质干细胞生长的影响试验中,EMP组细胞增殖指数为(61.00±0.72)%,显著高于空白对照组的(52.73±0.87)%(p<0.01),同时该组I、III型前胶原基因均有表达。
结论:EMP具有明显的抗氧化损伤作用,能够促进小鼠皮肤成纤维细胞增殖,有效抑制了细胞凋亡的发生,维持了氧化损伤中细胞膜、细胞骨架等亚细胞结构完整性和前胶原等基因的表达量;有效保护全层皮肤结构的完整性和紧密性,促进了氧化损伤后皮肤组织的修复,提高皮肤组织中抗氧化酶活性,并有效的清除活性氧自由基。EMP还具有明显的抗衰老作用,它不但能延长家蚕衰老模型的寿命,提高其抗逆能力,而且能有效激活全身抗氧化系统对家蚕局部皮肤损伤的应答作用。而EMP对骨髓间充质干细胞的生长则具有一定的干扰作用,在促进细胞增殖的同时,使得部分细胞发生了分化。
