5-氮杂2-脱氧胞苷、曲古抑菌素A联合紫杉醇与5-氟尿嘧啶对人胃腺癌细胞reprimo基因启动子甲基化的影响

背景和目的胃癌世界发病率在肿瘤中占第四，肿瘤相关死亡率高居第二。有研究报道早期胃癌患者的5年生存率达到95%，晚期胃癌的生存率只有10%～20%，严重危害着人类的健康。目前国际公认的晚期胃癌的治疗原则仍然是以化疗为主的综合治疗。虽然随着5-氟尿嘧啶类药物的广泛应用以及紫杉类、伊立替康和靶向药物等新药的应用，胃癌化疗疗效较前有所改善，但仍有相当比例的胃癌患者因为对常规化疗药物不敏感导致该部分胃癌患者临床治疗效果差，因此开辟胃癌新的临床治疗途径尤为重要。目前已知抑癌基因的异常甲基化不仅参与胃癌的发生发展，与胃癌细胞对化疗药物的敏感性也密切相关。本研究通过探讨5-氮杂2-脱氧胞苷（5-Aza-dC）、曲古抑菌素A（TSA）、紫杉醇联合5-氟尿嘧啶三者单独或联合对于不同分化程度的人胃腺癌细胞株MGC-803（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化）中reprimo基因甲基化和mRNA表达水平的影响，初步探讨5-Aza-dC、TSA、紫杉醇及5-氟尿嘧啶单独或联合使用对胃癌细胞生长及甲基化状态的影响。本研究在体外细胞实验的基础上，运用两种方法建立了胃癌裸鼠模型，比较两种建模方法，为进一步评价上述药物的体内作用及其机制等提供有力的实验工具。 材料与方法①采取5-Aza-dC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧啶三组药物单独或联合药的方式，对不同分化程度的胃腺癌细胞株MGC-803、SGC-7901及MKN-45细胞株进行处理，其中5-Aza-dC组：在细胞接种24小时后，用10μM的5-Aza-dC处理细胞72小时； TSA组：在细胞接种48小时后，用1μM的TSA的处理细胞48小时；紫杉醇+5-氟尿嘧啶组：加入0.3μM的紫杉醇和75mg的5-氟尿嘧啶处理细胞24小时；5-Aza-dC+TSA：细胞接种24小时后，用10μM的5-Aza-dC处理细胞24小时，然后加入1μM TSA同时处理48小时；紫杉醇+5-氟尿嘧啶+TSA组：向培养瓶内加入含1μM的TSA处理细胞48小时后加入0.3μM的紫杉醇和75mg/L的5-氟尿嘧啶，继续培养24小时；5-Aza-dC组+TSA组+紫杉醇联合5-氟尿嘧啶组：向培养瓶内加入10μM的5-Aza-dC，24h后加入1μM的TSA，48小时后加入0.3μM的紫杉醇和75mg/L的5-氟尿嘧啶，继续培养24小时；同时设立空白对照组（仅加入培养基培养），利用光学显微镜观察各种药物单独或联合处理前后胃癌细胞形态的变化，并利用台盼蓝染色方法测定各组细胞的活率。 ②采取5-Aza-dC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧啶三组药物单独或联合用药的方式，对不同分化程度的胃腺癌细胞株MGC-803、SGC-7901及MKN-45细胞进行处理，同时设立空白对照组，利用光学显微镜观察各种药物单独或联合处理前后胃癌细胞形态的变化，并利用台盼蓝染色方法测定各组细胞的活率； ③甲基化特异性PCR法（MSP）：采用MSP检测各组药物干预72小时后人胃腺癌MGC-803、SGC-7901、MKN-45细胞株中reprimo基因启动子区甲基化的状态。 ④逆转录PCR（RT-PCR）：采用RT-PCR检测各组药物干预72小时后人胃腺癌MGC-803、SGC-7901、MKN-45细胞株reprimo基因mRNA表达水平。 ⑤观察并比较人胃癌细胞悬液直接注射法和瘤转瘤法两种方法所建立的模型肿瘤移植成功率及瘤体生长速度，用甲基化特异性PCR法检测移植瘤组织中reprimo基因的甲基化水平并采用免疫组化法检测移植瘤的Ki-67和CD31分子表达。 结果①光学显微镜下观察发现三种不同分化的人胃腺癌细胞株MGC-803、SGC-7901、MKN-45形态均为上皮样，呈梭形，有些可见伪足，5-AzadC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧啶单药组；5-Aza-dC+TSA、5-Aza-dC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶、TSA﹢紫杉醇加5-氟尿嘧啶两药联合组；5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶三药联合组分别处理培养三组细胞株72小时后细胞体积增大，核缩小，核浆比减小，培养24小时即出现部分细胞呈多边形，72小时出现大量贴壁细胞悬浮，大部分细胞形态改变明显；单药处理组TSA比5-Aza-dC作用明显，紫杉醇+5-氟尿嘧啶最用最强；两药联合后作用比单药明显，TSA联合紫杉醇+5-氟尿嘧啶；三组药物联合处理作用更强；台盼蓝染色后以对照组细胞数为100％对药物处理组进行比较，单药组紫杉醇+5-氟尿嘧啶处理培养后细胞存活数相比5-Aza-dC、TSA少；两药联合组TSA联合紫杉醇+5-氟尿嘧啶细胞处理培养后存活数较其他两组少；发现三药联合处理培养后肿瘤细胞存活数最少。 ②MSP检测显示三种不同分化的人胃腺癌细胞株MGC-803、SGC-7901、MKN-45在对照组中reprimo基因启动子区CpG岛均表现为高甲基化，非甲基化呈微弱水平；给予5-Aza-dC组、TSA组、紫杉醇+5-氟尿嘧啶组、5-Aza-dC+TSA组、5-Aza-dC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶组、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶组、5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶组药物分别处理72小时后，单药组较对照组reprimo基因启动子区CpG岛发生DNA甲基化水平减低，非甲基化水平升高；两药联合组较单药组reprimo基因启动子区CpG岛发生DNA甲基化水平减低，非甲基化水平升高；三药联合组较两药联合组reprimo基因启动子区CpG岛发生DNA甲基化水平减低，非甲基化水平升高。 ③RT-PCR检测发现三种不同分化的人胃腺癌细胞株MGC-803、SGC-7901、MKN-45在对照组中mRNA表达水平低，5-AzadC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧啶、5-Aza-dC+TSA、5-Aza-dC+紫杉醇加5-氟尿嘧啶、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶、5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶8组药物分别处理72小时后，MGC-803细胞株reprimo基因八组灰度比值分别为：对照组(0.1364±0.0279)、5-Aza-dC (0.3722±0.0259)、TSA(0.3368±0.0225)、紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.2059±0.0266)、5-Aza-dC+TSA(0.4370±0.0253)、5-Aza-dC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.4205±0.0424)、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶组(0.3492±0.0152)、5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.5569±0.0154)；SGC-7901细胞株reprimo基因八组灰度比值分别为：对照组(0.1713±0.0296)、5-Aza-dC (0.4285±0.0165)、TSA(0.3850±0.0103)、紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.2240±0.0355)、5-Aza-dC+TSA(0.4728±0.0222)、5-AzadC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.4270±0.0028)、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶组(0.3956±0.0186)、5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.5737±0.0157)；MKN-45细胞株reprimo基因八组灰度比值分别为：对照组(0.2096±0.0339)、5-Aza-dC (0.4564±0.0074)、TSA(0.4253±0.0091)、紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.2325±0.0156)、5-Aza-dC+TSA(0.4975±0.0136)、5-Aza-dC+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.4718±0.0151)、TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶组(0.4353±0.0111)、5-Aza-dC TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶(0.6097±0.0153)；三组细胞单药组较对照组reprimo基因mRNA表达水平升高（P<0.05）；两药联合组较单药组reprimo基因mRNA表达水平升高（P<0.05）；三药联合组5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶较两药联合组reprimo基因mRNA表达水平升高（P<0.05）。 ④细胞悬液直接注射组的瘤体成瘤速度较瘤转瘤组慢（P<0.05）；瘤转瘤组的瘤转瘤组的reprimo基因甲基化水平及Ki-67和CD31的表达均高于细胞悬液直接注射组（P<0.05）。 结论无药物处理的情况下，人胃腺癌细胞株MGC-803、SGC-7901、MKN-45形态均为上皮样，呈梭形，有些可见伪足，reprimo基因甲基化程度较高，mRNA表达水平较低，在给予5-Aza-dC、TSA、紫杉醇+5-氟尿嘧啶单独或联合处理后，上述细胞均出现不同程度的形态改变、reprimo基因甲基化程度降低、mRNA表达水平明显升高，其中以5-Aza-dC+TSA+紫杉醇+5-氟尿嘧啶联合组效果最为明显，上述结果为胃癌临床治疗及采用新的联合用药方案提供了重要的实验依据。胃癌裸鼠模型的建立，为进一步评价上述药物的体内作用及其机制等提供了有力的试验工具。