陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟果皮,具有理气健脾,燥湿化痰之功。传统中医药理论认为陈皮“陈久者良”,现有大量文献报道研究陈皮陈化机制,但研究结果不一,导致陈皮贮藏陈化过程中药效物质变化规律难以揭示。陈化是一个复杂的过程,研究证实茶叶、烟叶陈化过程中微生物具有重要的作用。因此,本研究借鉴茶叶、烟叶的陈化机制研究方法,以陈皮为研究对象,利用高通量测序技术结合传统纯培养方法对陈皮表面真菌群落结构组成进行了分析,明确陈皮真菌的群落类型;模拟高温高湿贮藏环境,使真菌处于最适生长环境中,测定了不同时期陈皮药效物质含量变化,并应用反接培养的方式,将优势菌株在陈皮药材上反接培养,测定反接培养后陈皮药材中药效物质成分的变化,明确影响药效物质变化的真菌类型;采用动物实验比较反接培养后陈皮与不同贮藏年限陈皮祛痰和抗氧化作用的差异,以期为陈皮陈化机制研究提供科学依据,具体研究内容如下:1.陈皮真菌群落结构组成分析1.1高通量测序首次利用高通量测序技术分析了茶枝柑C.reticu1ata‘Chachi’、樟头红C.reticulate Blanco cv、大红袍C.reticu1ata‘Dahongpao’3个品种6批陈皮样品中真菌群落结构和多样性,测序结果共得到可分类OTUs数目共3970个,于不同分类水平分属6个门、29个纲、86个目、174个科、272个属,6批样品中真菌群落组成相似度较高,其中优势菌均为子囊菌Ascomycota,6批样品中相对丰度最大的10个属分别为Xeromyces spp.、Microidium spp.、枝孢属（Cladosporium spp.）、青霉属（Penicillium spp.）、Xerochrysium spp.、曲霉属（Aspergillus spp.）、链格孢属（Alternaria spp.）、Strelitziana spp.、多臂菌属（Trichomerium spp.）、Erythrobasidium spp.。6批陈皮中真菌群落组成相似,但不同品种间优势菌属相对丰度各不相同。其中Xeromyces spp.、Xerochrysium spp.和曲霉属真菌在广陈皮（茶枝柑）中丰度最大,青霉属、枝孢属真菌在江西陈皮樟头红中丰度最大,Microidium spp.、枝孢属、青霉属真菌在川陈皮（大红袍）中丰度最大。1.2传统纯培养通过传统形态学与ITS分子生物学鉴定技术分离鉴定得到5个属11个种的微生物,包括曲霉属（Aspergillus spp.）3种,分别为黄曲霉A.flavus、黑曲霉A.niger和烟曲霉A.fumigatus;青霉属（Penicillium spp.）5种,分别为普通青霉P.commune、意大利青霉P.italicum、指状青霉P.digitatum、波兰青霉P.polonicum和扩展青霉P.expansum;毛霉属（Mucor spp.）真菌卷枝毛霉M.circinelloides,枝孢属（Cladosporium.spp.）真菌C.ipereniae及1种镰刀菌属（Fusarium spp.）真菌,其中优势菌属为青霉属和曲霉属真菌。本研究发现3个品种陈皮表面真菌结构组成相似,优势真菌群类为子囊菌门真菌,可培养真菌主要为青霉属和曲霉属真菌,与课题组前期研究报道一致,该研究结果为研究陈皮在贮藏过程中微生物群落结构多样性奠定基础。2.真菌对陈皮药效物质影响研究2.1模拟高温高湿贮藏条件对陈皮药效物质的影响模拟高温高湿贮藏条件,使真菌处于最适生长环境中,利用UV紫外-可见光分光光度法、HPLC高效液相法测定不同时期陈皮中总黄酮、3种黄酮类成分（橙皮苷、川陈皮素、桔红素）、辛弗林、多糖和总酚酸的含量,结果发现3批样品中药效物质均发生变化,其中总黄酮与橙皮苷的含量呈先增后减的趋势,川陈皮素含量呈增加趋势,多糖和辛弗林含量下降。提示陈皮在贮藏过程中真菌对其有效性的影响具有两面性,一面是引起药效物质含量增加,提升药材品质,另一方面真菌生长消耗药效物质,导致陈皮品质劣变。2.2优势真菌黑曲霉对陈皮药效物质的影响以陈皮中分离得到的5株黑曲霉为研究对象,采用反接培养的方式,将黑曲霉接入陈皮药材上进行发酵培养,测定了反接培养后陈皮中总黄酮、3种黄酮类成分、辛弗林、多糖和总酚酸的含量,并进行了HPLC指纹图谱对比研究。含量测定结果表明,5株黑曲霉均引起陈皮药效物质含量和组成发生变化,不同菌株对药效物质的影响不同,5株黑曲霉引起陈皮川陈皮素含量增加,多糖和辛弗林含量降低,其中3株黑曲霉引起总黄酮含量增加。总黄酮分别增加了15%、13%、19%;,川陈皮素分别增加了2%、12%、17%、5%、5%,多糖含量分别减少了28%、22%、43%、34%、38%,辛弗林含量分别降低了16%、58%、58%、70%、22%。橙皮苷、桔红素含量变化不一,总酚酸无明显变化。指纹图谱对比结果首次发现陈皮经黑曲霉反接培养后,样品色谱峰个数及峰面积均发生了变化,共有13个成分明显增加,其中3个成分为5个反接样品共有的增加成分。研究结果首次发现:黑曲霉引起了陈皮中黄酮类成分含量变化和种类的增加,证明真菌导致了陈皮药效物质含量和组成发生变化。3.陈皮反接培养后与不同贮藏年限陈皮祛痰、抗氧化作用比较研究选择贮藏年限1年陈皮,将分离得到的5株黑曲霉反接到陈皮上发酵培养,采用酚红作为祛痰效果指示剂,根据气管酚红溶出液吸光度判断陈皮祛痰效果,结果发现与空白组相比,陈皮经黑曲霉反接培养后与1年、3年、5年陈皮酚红排泌量显著升高。各反接培养组间及不同贮藏年限陈皮组间酚红排泌量均无明显差异。CCl4诱导的小鼠急性肝损伤动物模型是经典的氧化性肝损伤动物模型,采用CCl4诱导肝损伤模型,研究陈皮反接培养后与1年、3年、5年陈皮的抗氧化作用,结果表明,陈皮经黑曲霉反接培养后和不同贮藏年限陈皮均对CCl4诱导的急性肝损伤模型小鼠具有保护作用,2批黑曲霉反接陈皮与3年、5年陈皮能明显升高模型小鼠SOD含量,降低MDA含量,其抗氧化作用强于1年陈皮,与5年陈皮相当。综上,本文通过探究真菌与陈皮品质间的相关性阐释陈皮陈化机制。研究结果首次发现黑曲霉可以提高陈皮黄酮类成分含量,并对其进行生物转化,使黄酮类组分类别发生变化,其抗氧化和祛痰作用有一定增强趋势,初步证实在陈皮陈化过程中真菌可提升陈皮品质,研究结果为阐释陈皮陈化过程中陈化机制、微生物作用机理提供科学依据,也为其他陈药研究提供借鉴和参考。
