鸡腿菇菌种质量检测技术研究

食用菌菌种是食用菌生产环节中的源头性生产资料,食用菌菌种质量的好坏直接影响食用菌生产管理过程以及产品质量与产量,关系着食用菌产业能否得到良好的发展环境问题。本研究以Co.0001、Co.0003、Co.0004和Co.0058这四株鸡腿菇为材料,从其菌种活力、菌种纯度和菌种种性三个大的方面展开研究,最后建立了一套比较完整的鸡腿菇菌种质量检测技术。本文主要研究内容如下: 1.菌种种性 以4株鸡腿菇菌种、3株金针菇菌种和2株草菇菌种为材料,分别提取其DNA并进行ITS-PCR扩增,根据ITS片段大小可以将鸡腿菇与金针菇区分开来,而不能将鸡腿菇与草菇区分开,为此,又对鸡腿菇和草菇菌种进行ITS-RFLP分析,结果表明鸡腿菇菌种种内的ITS序列保守性极强,ITS-RFLP不能达到鉴别鸡腿菇种内个体水平的目的,但能将种与种之间的菌种鉴别开。通过对NCBI上确定的鸡腿菇序列进行DNAMAN分析,并结合本实验室已研究过的其它29个种属菌种的ITS片段大小及4种相关限制性内切酶的酶切图谱,可以将鸡腿菇菌种与其它29个种属菌种区分开。通过ITS-RFLP分析可以实现鸡腿菇在种水平上的鉴定。 在种的水平上确定为鸡腿菇后还需对种内个体进行鉴定,本试验对鸡腿菇种内的4个不同的个体进行IGS分析,结果表明,4株鸡腿菇IGS1-RFLP的酶切图谱完全一致,IGS1-RFLP不能将鸡腿菇种内个体鉴别开;4株鸡腿菇的IGS2片段大小的呈现多态性,IGS2-PCR能将菌种Co.0001与其它三种鸡腿菇区分开来。本试验以Co.0058菌株为例,将同一Co.0058母种转接为2个Co.0058菌种,一个作为标准菌种,另一个作为待检菌种,以Co.0001作为对照菌株,对这三个菌种进行IGS2、RAPD和SRAP三种分子标记扩增,结果从60个RAPD和80对SRAP随机引物中分别筛选出9个和8对特异性引物,加上1对IGS2引物共18种引物组合中,标准菌种和待检菌种的指纹图谱完全一致,且与对照菌株相比能扩增出25条稳定性好,重复性高的特异性条带,即能证明待检菌株是Co.0058。因此,在对待检菌种进行品种鉴定时,不论利用IGS、RAPD、ISSR、SRAP四种技术中的哪几种技术,只要待检菌株与标准菌株的扩增图谱相同,且与对照菌株相比能得到足够多的特异性片段,即可以在鸡腿菇种内个体水平上对其进行鉴别。 2.菌种纯度 以正常无污染的鸡腿菇菌种为材料,分别接种不同浓度的大肠杆菌,使之形成隐性污染。采用4种方法对隐性污染菌种进行检测,结果表明:4种方法均能检测出细菌的存在;其中,液体摇瓶法的检测灵敏度最高,达到的检测极限为103个细菌/克菌丝,涂平板法能检测到104个细菌/克菌丝,平板划线法和煮沸PCR法的检测极限最低,为105个细菌/克菌丝。 人为地向正常原种中混入不同浓度的霉菌孢子,利用PDA培养法进行检测,可以检测到每克菌丝混有67个木霉孢子的水平。 对三种鸡腿菇菌种提取dsRNA,并对其提取物进行DNaseⅠ和RNaseA酶解,可以检测菌种内dsRNA的存在情况,本次实验结果发现Co.0003、Co.0004和Co.0058三种鸡腿菇均不存在dsRNA病毒。 3.菌种活力 以三个鸡腿菇菌种不同菌龄的菌丝为材料,测定了菌种老化过程中的生物学指标和生理生化指标,分析结果表明,三种鸡腿菇菌种随着菌龄增加,其菌丝长势和耐高温能力都有不同程度的减弱。六种酶活测定中,纤维素酶、多酚氧化酶和蛋白酶与菌龄都存在极显著相关,其中,多酚氧化酶与菌龄存在极显著正相关;纤维素酶和蛋白酶与菌龄存在显著负相关。而淀粉酶、漆酶和TTC-脱氢酶与菌龄没有显著的内在关系。所以,从菌丝长势,耐高温能力,纤维素酶、多酚氧化酶和蛋白酶活力测定中能判定鸡腿菇菌种的老化程度。