黄连多糖的提取、分离及抗大鼠2型糖尿病作用的实验研究

糖尿病（DM）是一种以高血糖为特点、由胰岛素分泌不足或功能下降所导致的疾病，最终可以引起糖、脂和蛋白质代谢损伤。预计到2030年，全世界糖尿病患者的数量将会增加到3亿人，而其中的95%为2型糖尿病（T2DM）。T2DM以胰岛素抵抗为特征，胰岛素抵抗指胰岛素在诸如肌肉、脂肪和肝脏等靶组织中调节糖平衡能力的降低。胰岛素抵抗虽然不是T2DM最主要的病理性损害特征，但其是导致高血糖、高血脂、肥胖和高血压等许多并发症的主要原因。因此，改善胰岛素抵抗已成为治疗T2DM最为可行的途径之一。目前，糖尿病的治疗方法包括注射胰岛素和口服降血糖药物，但是这些方法在临床应用过程中也可以导致某些副作用，例如高剂量的应用胰岛素和口服降血糖药物可以引起低血糖、肝脏损伤、乳酸中毒和腹泻等。因此，寻找天然的，无毒的抗糖尿病药物是非常必要的。 黄连（Coptis chinensis Franch）为毛茛科植物，是传统中药材之一，应用广泛，具有抗糖尿病、抗炎、抗癌等多种药理作用。早期的研究表明黄连素等生物碱为其抗糖尿病的活性成分。最近的研究发现，黄连水煎剂能够比黄连素或总生物碱产生更为明显的降血糖活性。同时，也有研究指出，非生物碱类提取物能显著的促进培养的脂肪细胞3T3-L1对葡萄糖的摄取能力。这些结果表明，黄连中的非生物碱类的水溶性成分具有改善糖尿病及其并发症的作用，而多糖为其主要的水溶性成分之一。关于黄连多糖的生物学活性的研究报道较少，主要涉及抗菌、抗氧化和抑制内皮细胞增殖等方面，并没有涉及其抗糖尿病作用。 因此，为了探讨黄连多糖的抗糖尿病作用及其机制，本研究从黄连多糖提取、分离方法的建立，黄连多糖抗大鼠2型糖尿病作用和黄连多糖对胰岛素信号通路的影响等三方面的内容展开了研究。 一、黄连多糖提取及精制工艺研究 对黄连多糖的提取工艺、精制工艺及定性、定量分析方法进行了研究。最佳提取工艺为：药材粉碎过40目筛，以蒸馏水为提取溶剂，采用回流提取法，料液比为1:10，提取温度100℃，提取时间45min，提取3次。经重复性实验验证，其工艺稳定，多糖的平均收率为1.52%。黄连多糖提取后需采用醇沉、脱色、去蛋白等步骤对其进行精制。最佳精制工艺为：3倍的90%乙醇，醇沉3次；用4%H2O2脱色，脱色时间120min，脱色温度45℃，溶液pH为7.0；采用Sevag法除蛋白，蛋白去除率达到81.3%。经定性和定量分析表明，用上述方法得到的黄连多糖为非还原性多糖，总糖含量为88.73%，糖醛酸含量为29.92%，蛋白质含量为2.85%。 二、黄连多糖抗大鼠2型糖尿病作用的实验研究 通过高脂饮食联合STZ诱导的方法，成功的建立了2型糖尿病大鼠模型。给予模型大鼠黄连多糖后，模型大鼠精神状态明显好转，体重下降趋势有所减弱，高血糖水平能被各剂量组的黄连多糖显著抑制；同时，通过IPGTT实验证实，黄连多糖可以提高糖尿病大鼠对葡萄糖的耐受能力；此外，黄连多糖可以增加模型大鼠的血清胰岛素水平，提高胰岛素敏感指数。黄连多糖也可以使NEFA/FFA、TG和TC水平均明显下降，说明其具有调节糖尿病大鼠血脂代谢紊乱的作用。给予模型大鼠黄连多糖4周后，肝脏组织中GSH含量增加，GSH-Px活力增强；同时，可以显著提升糖尿病大鼠肝脏中SOD和CAT活性，减少MDA含量。以上研究结果证实，黄连多糖可提高模型大鼠抗氧化物酶的活性和降低脂质过氧化物的含量，从而增强清除自由基的能力和降低ROS的产生，起到抗氧化应激、防止氧化损伤的作用，这可能是其抗糖尿病及改善胰岛素抵抗作用的原因。 三、黄连多糖对胰岛素信号转导通路的影响 为了进一步探讨黄连多糖的抗糖尿病及改善胰岛素抵抗的机制，本研究采用RT-PCR法测定了JNK和Glut4在mRNA水平上的表达，采用Western blot法测定了JNK、Phospho-IRS1（Ser307）、IRS1、PI3Kp85、PI3K和Glut4在蛋白水平上的表达。结果表明，同模型组相比，黄连多糖可以在mRNA水平上抑制JNK的表达，提高Glut4的表达。在蛋白水平上黄连多糖可抑制模型大鼠Phospho-IRS1（Ser307）的表达，提高PI3Kp85和Glut4的表达，对IRS1和PI3K的表达无显著性影响。大量研究表明，氧化应激与糖尿病和胰岛素抵抗的产生密切相关，氧化应激可以使JNK产生增加，从而使IRS1（Ser307）磷酸化，最终产生胰岛素抵抗。本部分实验进一步证实了黄连多糖可以通过抗氧化应激作用，使模型大鼠中JNK表达减少，从而抑制IRS1（Ser307）磷酸化作用，使PI3Kp85表达增加，进而影响整条PI3K通路，使Glut4表达增加，最终起到抗糖尿病和改善胰岛素抵抗的作用。 综上所述，本研究成功的建立了黄连多糖的提取工艺、精制工艺及定性、定量分析方法。通过给予T2DM大鼠黄连多糖后，证实其具有抗糖尿病及改善胰岛素抵抗的作用。黄连多糖的抗糖尿病及改善胰岛素抵抗作用与其抗氧化应激作用有关，通过抑制JNK在模型大鼠体内的表达，使IRS1（Ser307）磷酸化减少，进而促进InsR与IRS1结合，激活PI3K通路，增加Glut4的表达，最终起到抗糖尿病及改善胰岛素抵抗的作用。