目的：
研究藻酸钠复合关节软骨细胞体外培养的生物学特性及中药提取物黄芪甲苷对其的影响。以便为了解黄芪甲苷对软骨组织工程实验中软骨细胞的作用进行前期的探索研究。
1与前期实验相结合利用机械和酶消化法进行软骨细胞的消化、培养与传代；
2.研究在三维培养下黄芪甲苷对软骨细胞增殖的影响。
3.研究黄芪甲苷在三维培养下对软骨细胞合成ECM能力的影响。
4.探讨黄芪甲苷对三维培养上软骨细胞增殖的最大药效浓度和单层培养时是否相同。
方法：
1.采用机械和酶消化法分离、收集软骨细胞,并行细胞的单层培养,以获取大量的种子细胞,为下一步软骨细胞的三维培养提供种子细胞的来源。
2.以黄芪甲苷作为生长刺激因子,设单层培养组、空白对照组(用微珠载体加培养液培养),实验组(用微珠载体加含黄芪甲苷的培养液培养)分别为培养液中黄芪甲苷浓度为20μg/ml、40μg／ml、80μg/ml：
(1)二代细胞以每个微珠含有5*10E5个软骨细胞的藻酸钙置入6孔培养板中分别加入20%胎牛血清的DMEM培养液和不同浓度的黄芪甲苷进行培养,各组分别在培养的第1、2、4、6周的相同时间消化藻酸钙微珠并细胞计数,绘制各组细胞生长曲线图,比较各组细胞增殖情况差异；
(2)软骨细胞的单层培养组、空白对照组和实验组分别在培养2、4、6周后,单层培养组做细胞爬片,三维培养组做石蜡切片,分别做HE染色、甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组化,检测各组软骨细胞合成PG及Ⅱ型胶原的能力差异。
结果：
1.软骨细胞在单层培养时早期(1周内)的增殖速度明显高于三维培养中软骨细胞的增殖速度,但随着时间的延长(第1-2周后),软骨细胞的增殖率降低；2周后软骨细胞长满底壁后软骨细胞数量有轻微下降趋势。
2.软骨细胞在三维培养的第1、2、4、6周,实验组的40ug组及80ug组相对于空白对照组来说,细胞的增殖速度优于空白对照组,具有统计学意义(P<0.01)。
3.在空白对照组和三组不同浓度的实验组中,软骨细胞在2、4、6周经HE染色均显示细胞及胞核形态良好,经甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色后,单层培养组在第2周阳性表达最强,4周、6周后阳性表达逐渐减弱；三维培养组的细胞经染色呈阳性表达,且实验组的细胞异染反应明显高于空白对照组。
结论：
本实验研究显示:
1.刚削取的软骨块在经Ⅱ型胶原酶消化时要控制好消化时间,一般在3小时左右消化最理想,超过6小时则易造成细胞损伤。细胞传代在经胰蛋白酶消化时,要严格控制消化时间及胰蛋白酶的浓度,否则极易造成细胞损伤。
2.短期内在单层培养条件下软骨细胞的增殖速度明显高于三维培养组,但是后期增殖速度低于三维培养组。
3.在软骨细胞的三维培养中黄芪甲苷具有促进软骨细胞增殖、合成细胞ECM等作用。
4.藻酸钙载体有助于维持细胞表型的作用,对于构建软骨组织是可行的。
