银翘散君臣药活性成分对Ⅳ增殖及Ⅳ肺炎小鼠细胞凋亡相关基因表达干预作用的研究

目的： 通过薄层色谱和高效液相色谱法对传统中药复方银翘散君药金银花、连翘及称药之一牛蒡子抗甲型流感病毒（Ⅳ）FM1株的活性成分进行分析，阐明银翘散抗Ⅳ作用的物质基础；研究金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物体外直接抑制Ⅳ作用及对Ⅳ感染鸡胚的预防和治疗作用，并探讨时-效，量-效相关性；研究金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物对小鼠流感病毒肺炎的治疗作用，并从调控细胞凋亡信号转导相关基因Fas／FasL、TNF-α／TNFRⅠ的表达探讨药物作用机制。 方法： 1．采用乙醇提取方法制备金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物，并应用薄层色谱和高效液相色谱法对有效成分定性定量分析。 2．采用血凝试验观察不同浓度金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物不同时间点体外直接抑制Ⅳ作用；研究不同浓度金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物对Ⅳ感染鸡胚的预防和治疗作用。 3．采用鼻腔接种甲型流感病毒FM1株诱导幼龄昆明种小鼠肺炎，应用RT-PCR技术检测肺组织ⅣRNA表达，结合组织形态学、肺指数等指标，鉴定小鼠流感病毒肺炎模型。 4．将金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物以灌胃给药途径治疗小鼠流感病毒性肺炎，观察各组药物对小鼠一般状态、肺指数、肺组织形态学及对ⅣRNA表达的影响，阐明其对流感病毒肺炎治疗作用。 5．采用免疫组化法检测各组小鼠给药后肺组织Fas、FasL蛋白表达情况；采用RT-PCR技术检测各组小鼠给药后肺组织TNF-α、TNFRⅠmRNA表达情况。初步探讨银翘散君臣药活性成分对肺组织细胞凋亡信号转导通路的调控。 结果： 一、体外实验 1．金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物在TD0、1／2TD0和1／4TD0可不同程度预防流感病毒在鸡胚内增殖，其预防作用随药物浓度降低而减弱，但各浓度之间无显著差异（P＞0.05），各中药组在TD0时预防流感病毒效果强于病毒唑组，有显著差异（P＜0.05）。金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物在TD0、1／2TD0和1／4TD0均对感染Ⅳ鸡胚具有不同程度治疗作用，其治疗作用随浓度降低而减弱，但各浓度间无显著差异（P＞0.05）。各中药组各浓度治疗效果与病毒唑组比较均无显著差异（P＞0.05）。（3）两两比较各中药治疗组在TD0时抗流感病毒效果，无论在预防作用还是治疗作用方面，均无显著差异（P＞0.05）。 2．金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物在体外可直接抑制甲型流感病毒活性，作用时间从1h持续到24h。各时间点各组中药提取物在最大不凝血浓度即金银花25mg／ml、连翘50mg／ml、牛蒡子100mg／ml、配伍组50mg／ml时，均能完全抑制病毒的活性，随着药物浓度的降低，对病毒的抑制作用逐渐减弱。金银花组浓度为12.5mg／ml时在14、16小时效果较好，分别抑制病毒滴度16倍和19倍；连翘组浓度25mg／ml在4小时～14小时范围内抑制病毒效果显著，最高可达48倍，浓度为12.5mg／ml时在14小时抑制作用可达16倍；牛蒡子组50mg／ml作用效果在14小时达到高峰，为19.2倍，24小时抑制作用达到12倍，浓度为25mg／ml在24小时可达12倍；配伍组25mg／ml抑制病毒作用在4小时、8小时、14小时、16小时和24小时五个时间点分别达到16倍、27倍、27倍、19倍和12倍，12.5mg／ml在8小时可抑制病毒滴度16倍。 二、体内实验 1．模型复制：流感病毒肺炎模型组在感染5天后，肺组织中检测到ⅣRNA大量表达，肺指数增高，病理改变呈间质性肺炎病变：肺泡间隔水肿、炎细胞浸润，肺泡腔内浆液性渗出。 2．药物对流感病毒肺炎小鼠的治疗作用： （1）在改善肺炎小鼠一般状态方面，各组药均表现出明显的治疗作用，各治疗组小鼠的活动、精神状态、饮食、呼吸与模型组比较，均明显改善。 （2）在保护肺组织方面，各治疗组肺指数与病毒模型组比较均有显著差异（P＜0.01）；与西药对照病毒唑组比较，金银花组、连翘组及配伍组治疗效果无显著差异（P＞0.05），牛蒡子组具有显著差异（P＜0.05）；各中药治疗组间两两比较，配伍组疗效明显优于牛蒡子组（P＜0.05）。光镜下观察肺组织形态表明，各治疗组肺组织病变与模型组相比均明显减轻。 （3）在抑制病毒复制方面，正常组肺组织中未检测到Ⅳ病毒核酸，病毒模型组在感染后第5天检测到大量ⅣRNA表达；金银花、连翘、牛蒡子、配伍组及西药对照病毒唑组病毒核酸含量检测强度均低于病毒模型组，且差异具有显著性（P＜0.01）；与西药对照比较，配伍组病毒核酸表达水平无显著性差异（P＞0.05），而各单味药组则有显著差异（P＜0.01，P＜0.05）。各中药治疗组间比较，配伍组病毒核酸水平低于单味药组，其中与连翘组和牛蒡子组间比较存在显著性差异（P＜0.05）。 3．药物对流感病毒肺炎小鼠肺组织细胞凋亡的调控： （1）正常组可检测到少量Fas、FasL蛋白表达，模型组与正常组比较，肺组织Fas、FasL表达明显增强（P＜0.01）；金银花组、连翘组、牛蒡子组、配伍组及病毒唑组的Fas、FasL表达明显低于模型组，差异具有显著性（P＜0.01）。与病毒唑组比较，配伍提取物降低Fas、FasL表达效果无显著差异（P＞0.05）。各中药治疗组在降低Fas蛋白表达方面相比较，配伍组优于单味药组，与牛蒡子组之间差异具有显著性（P＜0.05）；FasL蛋白表达各中药组间无显著性差异。 （2）正常组肺组织中检测到TNF-α和TNFRⅠmRNA少量表达，模型组在感染后第5天检测到大量TNF-α和TNFRⅠmRNA。金银花、连翘、牛蒡子、配伍组及西药对照病毒唑组TNF-α和TNFRⅠmRNA含量检测强度与内参比值均低于模型组，且差异具有显著性（P＜0.01）；与西药对照比较，配伍组TNF-α和TNFRⅠmRNA表达无显著差异（P＞0.05）；各中药治疗组间两两比较，配伍组TNF-αmRNA水平低于单味药组，其中与牛蒡子组间存在显著性差异（P＜0.05），TNFRⅠmRNA表达各中药组间无显著性差异。 结论： 1．金银花、连翘、牛蒡子及其配伍对流感病毒感染鸡胚均有不同程度的预防和治疗保护作用；各中药组的预防和治疗作用与药物浓度呈正相关，但各浓度间无显著差异，各组中药在最大无毒浓度时预防效果均优于西药对照；比较最大无毒浓度时金银花、连翘、牛蒡子及其配伍对流感病毒预防和治疗作用，各组无显著差异。 2．金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物均有不同程度的体外直接抑制Ⅳ作用；各组药直接抑制Ⅳ作用时间从1h可持续到24h，在不同时间点抑制病毒效果不同，存在时-效相关性；各时间点各组中药提取物在最大不凝血浓度均能完全抑制流感病毒FM1株活性，随着药物浓度的降低，对病毒的抑制作用逐渐减弱，存在量-效相关性。 3．采用Ⅳ鼻腔接种幼龄昆明种小鼠可以成功诱导流感病毒肺炎模型，采用组织形态观察、计算肺指数及RT-PCR检测病毒核酸可鉴定流感病毒肺炎模型。 4．金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物均有不同程度的抗流感病毒肺炎作用，配伍组治疗效果明显优于各单味药组，与西药对照病毒唑组无显著差异。 5．流感病毒性肺炎肺组织中凋亡相关基因Fas、FasL蛋白和TNF-α、TNFRⅠmRNA表达明显上调；金银花、连翘、牛蒡子及其配伍提取物对流感病毒性肺炎肺组织细胞凋亡相关基因表达具有抑制作用，配伍组对凋亡的调控更加显著。 6．绿原酸、连翘苷、牛蒡苷为银翘散及其君臣药体内外抗流感病毒的主要物质基础。