富血小板血浆对兔膝骨性关节炎的作用及机制研究

目的:观察富血小板血浆对兔膝骨关节炎模型软骨病理状态、IL-1β及Wnt/β-Catenin信号通路的影响,探讨其作用机制。方法:48只清洁级新西兰大白兔随机分为正常组(Normal group)、空白对照组(Sham group)、模型组(Model group)和实验组(PRP group),每组 12 只(n=12)。正常组左膝关节不做任何处理;空白对照组仅切开左膝关节腔,不做其他任何处理;模型组和实验组行改良Hulth法制作左膝关节骨关节炎模型。造模1周后对实验组动物取自体耳静脉血10ml,按Aghaloo法制备富血小板血浆0.8ml行左膝关节腔注射;空白对照组与模型组关节腔内按相同方法注射等量生理盐水(0.8ml)。一周注射一次,连续注射6周后对实验动物左膝关节进行X线摄片,肉眼和镜下观察软骨病理改变并进行评分;电镜下观察软骨细胞超微结构;免疫组化检测软骨中Ⅱ型胶原、IL-1β及滑膜中IL-1β的含量,ELISA法检测关节液、血清中IL-1β含量并进行相关性分析;实时定量PCR和Western Blot 分别检测 Wnt/β-Catenin 信号通路中 Wnt1、GSK-3β 及 β-catenin mRNA与蛋白的含量。结果:X线片观察正常组和空白对照组关节X线无明显变化;模型组膝内侧的股骨胫骨关节间隙变窄明显,关节面不平整,关节边缘有大量骨赘形成,可及呈高密度改变的软骨下骨;实验组关节退行性变化较模型组轻。关节软骨Pelletier JP及Mankin's评分正常组和空白对照组较模型组明显降低(P<0.05);实验组较模型组关节软骨Pelletier JP及Mankin's评分明显降低(P<0.05)。透射电镜观察到正常组和空白对照组软骨细胞病理改变不明显,模型组软骨细胞损伤程度较实验组重。Masson与甲苯胺蓝染色分别检测到正常组和空白对照组软骨中胶原与蛋白多糖含量染色面积率和平均灰度值较模型组明显增高(P<0.05);实验组较模型组染色面积率和平均灰度值明显增高(P<0.05)。免疫组化检测正常组和空白对照组软骨Ⅱ型胶原阳性细胞分数和平均积分光密度较模型组明显增高(P<0.05),实验组较模型组阳性细胞分数和平均积分光密度明显增高(P<0.05)。正常组和空白对照组软骨、关节液及血清中IL-1β含量明显低于模型组(P<0.05),实验组IL-1β含量明显低于模型组(P<0.05),且关节液与血清中IL-1β成正相关(r2=0.8702,P=0.0000)。倒置显微镜下观察发现体外培养的关节炎软骨细胞2代以内培养可以保持细胞表型稳定。富血小板血浆组软骨细胞中Wnt1和β-cateninmRNA及蛋白的表达量较生理盐水组明显减少(P<0.05);与抑制剂组比较富血小板血浆组Wnt1和β-cateninmRNA及蛋白的表达量增高(P<0.05),低于激动剂组(P<0.05);富血小板血浆组GSK-3β mRNA及蛋白的表达量较生理盐水组明显增加(P<0.05);与抑制剂组比较富血小板血浆组GSK-3βmRNA及蛋白表达量降低(P<0.05),富血小板血浆组GSK-3βmRNA及蛋白表达量明显高于激动剂组(P<0.05)。结论:富血小板血浆虽不能最终逆转骨关节炎的发展进程,但可通过降低主要致炎因子IL-1β的水平、降低Wnt/β-Catenin信号通路中Wnt1和β-catenin的水平,增加GSK-3β的水平起到减缓关节软骨病理损伤程度、抑制蛋白多糖与胶原的降解,在一定程度上延缓骨关节炎的发展进程,可能成为治疗骨关节炎的一种新的有效的手段。