课题组前期采用快速识别药物作用靶点的计算模拟方法,开展基于多受体结构库的药物靶点高通量筛选。研究发现,丹参酮ⅡA能够与雌激素受体强势结合,其完全水解产物对接结果示活性构象和雌二醇相似。推测丹参酮ⅡA在生物活性方面可能发挥了类雌激素效应,随即构建了细胞模型进行了鉴定,结果初步证实丹参酮ⅡA具有雌激素效应。
本实验首先观察了绝经后女性冠心病患者血清雌激素水平、血脂水平以及sICAM-1炎症因子与血瘀证的关系,同时借助ox-LDL诱导内皮细胞损伤模型及去卵巢ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)模型,观察丹参酮ⅡA对AS血管内皮保护、血管舒缩状态、AS程度、斑块稳定性、血清雌激素、炎症因子等表达水平的影响,并观察了ERK、MAPK、 PI3K/AKT等信号转导调控的变化,探索丹参酮ⅡA的血管保护效应及其对雌激素效应器信号转导通路的影响。
本论文分为三部分：文献综述、临床研究和实验研究。
1文献综述：综述一雌激素与动脉粥样硬化
综述二丹参酮ⅡA抗动脉粥样硬化作用的研究进展
2临床研究绝经后女性冠心病患者血清雌激素水平与血瘀证的相关性研究目的：观察绝经后女性冠心病血瘀证与非血瘀证两组患者血清雌激素水平有无差异。方法：冠心病诊断标准参照1999年美国心血管学会和美国心脏病协会制定的冠心病诊断标准,同时,根据1986年修订血瘀证诊断标准进行冠心病血瘀证诊断。选取首次诊断为冠心病的绝经后女性患者共43例,其中血瘀症23例,非血瘀症20例；同时选取绝经后健康女性40例。受检查者于入院后第二天清晨8：00抽取空腹静脉血,常规检查检测交由首都医科大学附属北京市安贞医院检验科。其余检测指标分离血清,-80℃保存,备用。ELISA法检测血清雌激素(E2),sICAM-1含量。并观察雌激素水平与血脂、sICAM-1的相关性。
结果：与健康对照组相比,冠心病组TC含量增加(P0.05),E2含量降低(P<0.05),其中冠心病血瘀证组E2有进一步下降趋势,而TC、血清sICAM-1水平却有升高趋势(P>0.05)。应用Pearson相关分析分析结果显示：在冠心病患者中,E：含量与TC、sICAM-1水平呈负相关。
结论：女性绝经后冠心病患者雌激素水平比健康者略低,且血瘀证有进一步下降趋势。3.实验研究分为细胞实验及动物实验两部分。
细胞实验丹参酮ⅡA对ox-LDL所致人脐静脉内皮细胞损伤的影响
目的：探索丹参酮ⅡA对内皮细胞损伤的保护机制。
方法：以体外培养HUVECs为研究对象,将ox-LDL以100μg/ml浓度干预除正常组外所有细胞,制造ox-LDL氧化损伤内皮细胞模型,在加入ox-LDL的同时各加药组加入相应的药物,共分为8个组：正常对照组(NOR),模型组(MOD),雌激素组(E：,0.01μM),雌激素+雌激素受体抑制剂ICI182780组(E2+ICT,E2:0.01μM,ICI:0.1μM),丹参酮ⅡA低剂量组(TLD,0.1μM),丹参酮ⅡA中剂量组(TMD,1μM),丹参酮ⅡA高剂量组(THD,10μM),丹参酮ⅡA中剂量组+雌激素受体抑制剂ICI182780(TMD+ICT,TMD:1μM, ICI:0.1μM).共同作用24h后进行细胞活性检测,取细胞培养上清液检测NO、 ET-1、NF-κB、sICAM-1、AP-1、E-selectin含量,Western blot法检测细胞p-p38. p-Akt、p-ERK1/2蛋白水平。
结果：
①MTT法细胞活性检测：与NOR组相比,MOD组细胞活性明显下降(P0.05)。
③相关蛋白检测结果显示：
与NOR组相比,MOD组脐静脉内皮细胞内p-p38、p-ERK1/2、p-Akt蛋白表达均明显增加(P<0.01或P<0.05)；与MOD组相比,E：组及丹参酮ⅡA各组蛋白表达均下降(P<0.01或P<0.05)；而E2+ICI组及TMD+ICI组蛋白水平下降不明显(P>O.05)。
结论：ox-LDL可致HUVECs损伤；丹参酮ⅡA能够通过抗氧化,抗炎,调节内皮功能而发挥对ox-LDI所致HUVECs损伤的保护作用,此作用与雌激素相似;雌激素血管保护效应是通过其与受体结合而实现的,该作用可以被受体拮抗剂抑制,而丹参酮ⅡA的血管内皮保护效应受雌激素受体拮抗剂影响,但并不能被完全抑制。
动物实验丹参酮ⅡA对去卵巢动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠血管内皮损伤的影响
目的：研究丹参酮ⅡA对去卵巢动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠血管内皮损伤作用及作用机制。
方法：采用高脂饲料喂养雌性去卵巢ApoE小鼠创建动脉粥样硬化模型,并共分为7组：正常对照组(NOR)、模型组(MOD)、雌激素组(E2,0.0001:3mg/g/d)、雌激素+雌激素受体拮抗剂(氟维司群注射液,0.065mg/g/m)组(E2+ICI)、丹参酮ⅡA低剂量(30mg/kg/d)组(TLD)、丹参酮ⅡA高剂量(60mg/kg/d)组(THD)、丹参酮ⅡA低剂量+雌激素受体拮抗剂(氟维司群注射液)组(TLD+ICI).普通饲料和高脂饲料喂养12周时,各组小鼠禁食12h,称量体重,摘除眼球取血,分离血清用于E2、NO、ET-1、NF-κB、AP-1、sICAM-1、E-selectin指标ELISA检测及SOD.MDA生化检测。取主动脉开口至距开口0.5cm的一段主动脉弓进行HE、油红0染色。取主动脉开口至腹主动脉分叉处的整段主动脉迅用于相关蛋白p-p38、p-ERK1/2、p-Akt的Western-blot检测。
结果：
①主动脉冰冻切片结果显示：除正常组外,各组小鼠主动脉均出现AS斑块形成。
②血清E2水平
与NOR组相比,MOD组血清E2水平明显降低(P<0.01)；与MOD组相比,E2及E2+ICI组E2水平上升(P<0.01),而丹参酮ⅡA组及加入抑制剂后的丹参酮ⅡA组E2水平无明显差异(P>0.05)。
②血清NO、ET-1的水平
与NOR组相比,MOD组NO水平明显降低(P<0.05),而ET-1水平明显升高(P<0.01)；与MOD组相比,E2及丹参酮ⅡA各组NO水平上升(P<0.05),而ET-1水平明显下降(P<0.01),但E2+ICI组及TLD+ICI组较MOD组无明显差异(P>0.05)。
③内皮损伤炎症及免疫相关细胞因子测定
与NOR组相比,MOD组血清NF-κB、AP-1、sICAM-1、E-selectin水平明显增高(P<0.01)；与MOD组相比,E2、TLD、THD组NF-κB、AP-1、sICAM-1、F-selectin水平明显降低(P<0.01),而E2+ICI及TLD+TCI组下降不明显(P>0.05)。
④抗氧化能力的测定
与NOR组相比,MOD组SOD活性明显降低(P<0.05),而MDA含量明显增加(P<0.01),与MOD组相比,E2、TLD、THD组SOD活性升高(P<0.01或P0.05)。
⑤相关蛋白表达
与NOR组相比,MOD组小鼠主动脉p-p38、p-ERK1/2、p-Akt蛋白表达均明显增加(Y<0.01或P<0.05);与MOD组相比,E：组与丹参酮ⅡA各组蛋白表达均下降(P<0.01或P<0.05),而E2+TCI组蛋白水平下降不明显(P>0.05)。
结论：apoE-/-动脉粥样硬化小鼠去卵巢后血清E2水平明显下降,AS程度加重；丹参酮ⅡA能够通过调节内皮功能,降低氧化应激和炎症反应,对动脉粥样硬化过程中的血管内皮损伤具有保护作用,与雌激素有类似作用,但二者的保护机制不完全相同。
